Журнал
ONCOLOGY.ru

Новые параметры гистологических изображений опухолевого лимфангиогенеза. Данные исследования 48 препаратов папиллярного рака щитовидной железы детского возраста

Спринджук М.В., Кончиц А.П.

Объединенный институт проблем информатики Национальной академии наук Беларуси, г. Минск, Беларусь


+375295671073

Ключевые слова: ангиогенез, лимфангиогенез, рак щитовидной железы, опухоли, карцинома, плотность микрососудов, обработка изображений, программное обеспечение.



Аннотация

Цель исследования – выяснить возможность предсказания факта метастазирования в шейные лимфатические узлы по данным анализа изображений опухолевого лимфангиогенеза с помощью линейной регрессии.

Материалы – препараты папиллярного рака щитовидной железы (48 шт), окрашенные иммуногистохимическим маркером D2-40. Цифровые изображения были получены с помощью микроскопа Leica DMD 108. Оригинальная программа вычисляла 5 параметров изображений: относительную площадь лимфатических капилляров, однородность, долю крупных и мелких объектов, цветность. Статистический анализ выполнялся компьютерными программами StatPlus, Statistica 2009.

Результаты
По результатам вычисления модели линейной регрессии, где параметры изображений были предикторами, а факт наличия метастазов в шейных лимфатических узлах – исходом, числовые значения доли мелких и крупных объектов оказались статистически значимыми (Двусторонний P = 0,0158, 95% доверительные интервалы, ДИ, = -10,417584 до1,13758; Р = 0,0224, 95% ДИ = -20,249792 до -1,619872, соответственно).

Заключение
В нашем исследовании наиболее адекватным параметром, полученным в результате анализа изображений опухолевого лимфангиогенеза, была относительная доля мелких объектов (ОДМО). Уравнение линейной регрессии имело следующий вид: Наличие метастазов = -5,777582 х ОДМО + 5,980355. Мы полагаем, что дальнейшие исследования должны быть направлены на изучение возможности параметров гистопатологических изображений, полученных с помощью программного обеспечения, предсказывать клинико-лабораторное состояние пациентов, что может иметь реальную практическую ценность и откроет новые пути понимания опухолевого ангио- и лимфангиогенеза.

Введение

Морфометрические методы исследования широко популярны в медицине, классические русскоязычные труды в этой области принадлежат профессору Г.Г. Автандилову [1-4].

Он – автор применяемой измерительной окулярной сетки, которая чаще используется для количественной оценки половых клеток. Аналог этого инструмента – сетка-гратикула Chalkley [5-15] (eyepiece, graticule). Микроскопическая патоморфология ангиогенеза (роста капилляров из уже сформированных таковых), а также васкулогенеза лимфатических капилляров до сегодняшнего времени оставались малоизученными по причине отсутствия надежных иммунохимических маркеров. Имеются единичные сообщения об изучении патоморфологии лимфангиогенеза в щитовидной железе [16-24]. Наше исследование ставило целью заполнить промежуток отсутствия исследований компьютер-ассиситированной морфометрии лимфангиогенеза рака щитовидной железы, болезни, которая, как известно, характерна для пост-Чернобыльских территорий.

Материалы и методы исследования

Исследование выполнялось по материалам Онкологического Диспансера г. Минска в течение 13 месяцев с 2009 по 2010 годы.

Критерии включения пациентов в исследование были следующие (см. также рис. 1-4):

  1. Дети были рождены позднее 1987;
  2. Все имели диагноз спорадичеcкого папиллярного рака щитовидной железы (на основании тонкоигольной биопсии и обследования удаленной опухоли);
  3. Возраст варьировал от 4 до 18 лет;
  4. У всех пациентов не было явной врожденной болезни и значительных сопутствующих патологий развития.

Препараты были приготовлены из хирургически удаленных опухолей (папиллярного рака щитовидной железы) пациентов. Образцы опухолей хранились в замороженном виде.

Использовалось специально разработанное программное обеспечение, которое обрабатывало изображения и считало 5 параметров: относительную площадь, занимаемую сосудами; однородность распределения сети в пространстве; относительную долю мелких объектов сосудов (шума); относительную долю крупных сосудов; среднее значение цветности выделяемых сосудов.

Программное обеспечение было написано на Delphi (то есть, фактически, объектно-ориентированном Паскале) для операционной системы Windows. Ключевая функция программного обеспечения – вычисление прокрашенной коричневым цветом области гистологического изображения. Изображения были получены при помощи микроскопа "Leica DMD 108" с операционной системой Linux. Снимки были получены вручную, без сканера – 150 изображений, которые в основном визуально соответствовали области максимальной васкуляризации по зрительному оценочному решению одного исследователя, как квадрат на увеличении х40, а затем сняты х200. После этого были отобраны изображения, исключительно содержащие околоoпухолевую зону (3-25 шт).

Все изображения были сохранены в формате Tiff, приемлемом для программного обеспечения.

Программное обеспечение произвело список числовых величин, который был импортирован в таблицу Excel. Статистическое исследование выполнялось преимущественно программным пакетом Statistica. Его концепция заключалась в модели простой линейной регрессии, где параметрам изображений придавалось значение предсказательных факторов, а факту наличия метастазов – исхода. Значение относительной ошибки Р считалось статистически значимым, если было менее 0,05.

Диаграмма возраста исследуемых больных

Рисунок 1. Диаграмма возраста исследуемых больных. По оси у – число наблюдений.


График преобладания размеров опухолей

Рисунок 2. График преобладания размеров опухолей (По оси х – в мм, по у – число наблюдений).


Клинико-морфологическая характеристика исследуемой группы пациентов

А)

Клинико-морфологическая характеристика исследуемой группы пациентов

Б)

Клинико-морфологическая характеристика исследуемой группы пациентов

В)

Клинико-морфологическая характеристика исследуемой группы пациентов

Г)

Рисунок 3. Клинико-морфологическая характеристика исследуемой группы пациентов.
На всех рисунках зеленым цветом выделяется наличие признака (1), а другими – его отсутствие (0).


Результаты

Только для двух числовых характеристик изображений модель линейной регрессии показала статистически значимые результаты. Этими параметрами были относительная доля мелких объектов сосудов, шума (ОДМО) и относительная доля крупных сосудов (ОДКО). Таким образом, мы получили два уравнения, образующие формулу предсказания локального лимфатического метастазирования:

Наличие метастазов = -5,777582 х ОДМО + 5,980355 (1)

Наличие метастазов = -10,934832 х ОДКО + 11,286063 (2)

Подробная характеристика применяемой статистической модели приведена в таблице 1.

Таблица 1. Параметры модели простой линейной регрессии.

Статистические
параметры модели
  Линейная регрессия для ОДМО   Линейная регрессия для ОДКО
Стандартная
oшибка (наклона)
  2,305138   4,627642
95% ДИ
для популяционного значения наклона
-10,417584 до
 -1,13758
-20,249792 до
-0,069329
95% ДИ
для r
(трансформированное число z Фишера)
-0,574215  до -0,069329 -0,560719 до -0,049493
t для значения степени свободы = 46 -2,506393 -2,362938
Двусторонний Р 0,0158 0,0224
Сила (для 5% значимости) 67,13% 62,21%
Общий результат Коэффициент корреляции значительно отличается от нуля Коэффициент корреляции значительно отличается от нуля

Обсуждение

Публикаций по теме лимфангиогенеза и лимфогенного метастазирования опухолей щитовидной железы немного [16-40]. Движущая сила научного продвижения этой области – недавнее появление лимфатических маркеров; среди них D2-40, который применялся в нашем исследовании (рис. 5). Антитело D2-40 первоначально реагирует с O-связанным гликопротеином, экспрессирующемся на лимфатическом эндотелии, эмбриональном яичке и опухолях яичек.

На сегодняшний день считается, что основные биохимические факторы развития лимфангиогенеза любой локализации – сосудистые эндотелиальные факторы роста (C, D, А, в порядке значения). Неизвестны механизмы увеличения ФРЭС (фактора роста эндотелия сосудов), и природа молекул, выполняющих активацию существующего лимфатического эндотелия, вызывающего увеличение размера опухоли с последующей продукцией митогенных и хемотаксических факторов или альтераций лимфатического эндотелия. Hall [41] и сотрудники, 2003, были первыми, кто исследовал морфологические особенности опухолевой лимфатической сети у больных, имеющих папиллярные карциномы щитовидной железы. В исследовании, используя LYVE-1 (Lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor) как маркера, сетки Chalkleу для подсчета сосудов, высокая ПЛК (плотность лимфатических капилляров) была связана с наличием региональных метастазов лимфатического узла. Однако, наличие внутриопухолевого лимфангиогенеза не было значительным предиктором рецидива опухоли (P = 0.42). Интересно, эксперимент Cheong [42, 43] и соавторов (2010) не показал значительных различий в плотности лимфатических и кровеносных капилляров сосочковых карцином щитовидной железы и микрокарцином (<1 см в размере). Однако более высокая ПЛК отмечалась у больных старше, чем 45 лет (более четко в группе крупных карцином) и имеющих мультицентральность с экстратиреоидным распространением. Мультицентральность была определена как наличие дополнительных фокусов опухоли, состоящих из нескольких несмежных с первичной опухолью участков. Экстратиреоидное распространение было определено как прорастание опухоли вне капсулы, окружающей мягкие ткани железы.

Классическим морфометрическим параметром оценки сети лимфатических капилляров является их площадь, прокрашенная диагностическим маркером [44-51]. В нашем исследовании применены новые параметры изображений. Как оказалось, доля мелких и крупных объектов характеризует морфологию сети лимфатических сосудов более подробно, чем просто площадь прокрашенного, и выявляет свою прогностическую ценность. Новые параметры изображений позволяют классифицировать морфологию ангиогенеза и выделять подгруппы морфологических паттернов.

Выводы и заключение

Впервые предложена простая математическая модель предсказания факта образования региональных лимфатических метастазов по данным компьютеризированной морфометрии опухолевого лимфангиогенеза. Можно предположить, что такой подход может быть применен к опухолям любой локализации. Безусловно, более достоверно доказать эти закономерности можно только проведя широкомасштабные многоцентровые исследования, реальность возможности выполнения которых в условиях современного экономического кризиса маловероятна.

А) Классические примеры папиллярного рака щитовидной железы, препараты окрашены гематоксилином, эозином и маркером D2-40. Лимфатические сосуды на изображениях выделяются коричневым цветом (х200).

Б) Классические примеры папиллярного рака щитовидной железы, препараты окрашены гематоксилином, эозином и маркером D2-40. Лимфатические сосуды на изображениях выделяются коричневым цветом (х200).

Рисунок 10 (а, б). Классические примеры папиллярного рака щитовидной железы, препараты окрашены гематоксилином, эозином и маркером D2-40. Лимфатические сосуды на изображениях выделяются коричневым цветом (х200).


Список литературы

  1. Avtandilov GG. Information characteristic of morphology of the adaptational norm, disadaptation, and pathology under the aspect of diagnostic microscopy. Gegenbaurs Morphol Jahrb. 1989;135(1):169-71.
  2. Avtandilov GG, Sorokina MV. [Use of multifactor mathematical modeling in studying the geographical pathology of human malignant tumors]. Vopr Onkol. 1980;26(12):64-8.
  3. Avtandilov GG. [Philosophical aspects of probability principles in the study of human pathology]. Arkh Patol. 1975;37(4):3-10.
  4. Avtandilov GG. [Perspectives in microspectrophotometric studies in pathology]. Arkh Patol. 1970;32(9):3-12.
  5. Ng L, Beer TW, Murray K. Vascular density has prognostic value in Merkel cell carcinoma. Am J Dermatopathol. 2008 Oct;30(5):442-5.
  6. Fox SB. Quantitative angiogenesis in breast cancer. Methods Mol Med. 2006;120:161-87.
  7. Reed AA, Joyner CJ, Brownlow HC, Simpson AH. Human atrophic fracture non-unions are not avascular. J Orthop Res. 2002 May;20(3):593-9.
  8. Edwards JG, Cox G, Andi A, Jones JL, Walker RA, Waller DA, et al. Angiogenesis is an independent prognostic factor in malignant mesothelioma. Br J Cancer. 2001 Sep 14;85(6):863-8.
  9. Offersen BV, Pfeiffer P, Hamilton-Dutoit S, Overgaard J. Patterns of angiogenesis in nonsmall-cell lung carcinoma. Cancer. 2001 Apr 15;91(8):1500-9.
  10. Chaudhary R, Bromley M, Clarke NW, Betts CD, Barnard RJ, Ryder WD, et al. Prognostic relevance of micro-vessel density in cancer of the urinary bladder. Anticancer Res. 1999 Jul-Aug;19(4C):3479-84.
  11. Decaussin M, Sartelet H, Robert C, Moro D, Claraz C, Brambilla C, et al. Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its two receptors (VEGF-R1-Flt1 and VEGF-R2-Flk1/KDR) in non-small cell lung carcinomas (NSCLCs): correlation with angiogenesis and survival. J Pathol. 1999 Aug;188(4):369-77.
  12. Fox SB, Turner GD, Leek RD, Whitehouse RM, Gatter KC, Harris AL. The prognostic value of quantitative angiogenesis in breast cancer and role of adhesion molecule expression in tumor endothelium. Breast Cancer Res Treat. 1995;36(2):219-26.
  13. Dickinson AJ, Fox SB, Persad RA, Hollyer J, Sibley GN, Harris AL. Quantification of angiogenesis as an independent predictor of prognosis in invasive bladder carcinomas. Br J Urol. 1994 Dec;74(6):762-6.
  14. Fox SB, Leek RD, Smith K, Hollyer J, Greenall M, Harris AL. Tumor angiogenesis in node-negative breast carcinomas--relationship with epidermal growth factor receptor, estrogen receptor, and survival. Breast Cancer Res Treat. 1994 Jan;29(1):109-16.
  15. Engels K, du Bois A, Harter P, Fisseler-Eckhoff A, Kommoss F, Stauber R, et al. VEGF-A and i-NOS expression are prognostic factors in serous epithelial ovarian carcinomas after complete surgical resection. J Clin Pathol. 2009 May;62(5):448-54.
  16. Scarpino S, Di Napoli A, Melotti F, Talerico C, Cancrini A, Ruco L. Papillary carcinoma of the thyroid: low expression of NCAM (CD56) is associated with downregulation of VEGF-D production by tumour cells. J Pathol. 2007 Aug;212(4):411-9.
  17. Furtado GC, Marinkovic T, Martin AP, Garin A, Hoch B, Hubner W, et al. Lymphotoxin beta receptor signaling is required for inflammatory lymphangiogenesis in the thyroid. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Mar 20;104(12):5026-31.
  18. de la Torre NG, Buley I, Wass JA, Turner HE. Angiogenesis and lymphangiogenesis in thyroid proliferative lesions: relationship to type and tumour behaviour. Endocr Relat Cancer. 2006 Sep;13(3):931-44.
  19. Liang QC, Wei QY, Fan SQ. [Expression of VEGF-C and angiogenesis, and lymphangiogenesis in papillary thyroid carcinoma]. Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2006 Jun;31(3):414-6, 9.
  20. Nakamura Y, Yasuoka H, Zuo H, Takamura Y, Miyauchi A, Nakamura M, et al. Nitric oxide in papillary thyroid carcinoma: induction of vascular endothelial growth factor D and correlation with lymph node metastasis. J Clin Endocrinol Metab. 2006 Apr;91(4):1582-5.
  21. Yu XM, Lo CY, Chan WF, Lam KY, Leung P, Luk JM. Increased expression of vascular endothelial growth factor C in papillary thyroid carcinoma correlates with cervical lymph node metastases. Clin Cancer Res. 2005 Nov 15;11(22):8063-9.
  22. Jiang HG, Gao M, Tang WP, Li FH, Cai QZ. [Expression and significance of VEGF, VEGF-C, and VEGF-D in papillary thyroid carcinoma]. Ai Zheng. 2005 Sep;24(9):1136-9.
  23. Giorgadze TA, Baloch ZW, Pasha T, Zhang PJ, Livolsi VA. Lymphatic and blood vessel density in the follicular patterned lesions of thyroid. Mod Pathol. 2005 Nov;18(11):1424-31.
  24. Yasuoka H, Nakamura Y, Zuo H, Tang W, Takamura Y, Miyauchi A, et al. VEGF-D expression and lymph vessels play an important role for lymph node metastasis in papillary thyroid carcinoma. Mod Pathol. 2005 Aug;18(8):1127-33.
  25. Koo BS, Lim HS, Lim YC, Yoon YH, Kim YM, Park YH, et al. Occult contralateral carcinoma in patients with unilateral papillary thyroid microcarcinoma. Ann Surg Oncol. 2010 Apr;17(4):1101-5.
  26. Koo BS, Seo ST, Lee GH, Kim JM, Choi EC, Lim YC. Prophylactic lymphadenectomy of neck level II in clinically node-positive papillary thyroid carcinoma. Ann Surg Oncol. 2010 Jun;17(6):1637-41.
  27. Koo JS, Kwak JY, Jung W, Hong S. Importance of foamy macrophages only in fine needle aspirates to cytologic diagnostic accuracy of cystic metastatic papillary thyroid carcinoma. Acta Cytol. 2010 May-Jun;54(3):249-54.
  28. Macdonald KI, Taylor SM, Cavanagh J, Trites JR, Bullock MJ, Hart RD. Level VI node size as a predictor of malignancy in papillary thyroid cancer. J Otolaryngol Head Neck Surg. 2010 Apr;39(2):136-41.
  29. Martino A, Monaco L, Golia R, Miletto P, Capasso P, Lombardi C, et al. A new radioguided procedure for localization and surgical treatment of neck node metastasis of papillary thyroid cancer. J Endocrinol Invest. 2010 May;33(5):339-42.
  30. Mitchell JC, Parangi S. Angiogenesis in benign and malignant thyroid disease. Thyroid. 2005 Jun;15(6):494-510.
  31. Salter KD, Andersen PE, Cohen JI, Schuff KG, Lester L, Shindo ML, et al. Central nodal metastases in papillary thyroid carcinoma based on tumor histologic type and focality. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 2010 Jul;136(7):692-6.
  32. Vergez S, Sarini J, Percodani J, Serrano E, Caron P. Lymph node management in clinically node-negative patients with papillary thyroid carcinoma. Eur J Surg Oncol. 2010 Aug;36(8):777-82.
  33. Wang W, Wang H, Teng X, Mao C, Teng R, Zhao W, et al. Clonal analysis of bilateral, recurrent, and metastatic papillary thyroid carcinomas. Hum Pathol. 2010 Sep;41(9):1299-309.
  34. Yuce I, Cagli S, Bayram A, Karasu F, Guney E. Regional metastatic pattern of papillary thyroid carcinoma. Eur Arch Otorhinolaryngol. 2010 Mar;267(3):437-41.
  35. Al-Saif O, Farrar WB, Bloomston M, Porter K, Ringel MD, Kloos RT. Long-term efficacy of lymph node reoperation for persistent papillary thyroid cancer. J Clin Endocrinol Metab. 2010 May;95(5):2187-94.
  36. Baek SK, Jung KY, Kang SM, Kwon SY, Woo JS, Cho SH, et al. Clinical risk factors associated with cervical lymph node recurrence in papillary thyroid carcinoma. Thyroid. 2010 Feb;20(2):147-52.
  37. French JD, Weber ZJ, Fretwell DL, Said S, Klopper JP, Haugen BR. Tumor-associated lymphocytes and increased FoxP3+ regulatory T cell frequency correlate with more aggressive papillary thyroid cancer. J Clin Endocrinol Metab. 2010 May;95(5):2325-33.
  38. Hung CJ, Ginzinger DG, Zarnegar R, Kanauchi H, Wong MG, Kebebew E, et al. Expression of vascular endothelial growth factor-C in benign and malignant thyroid tumors. J Clin Endocrinol Metab. 2003 Aug;88(8):3694-9.
  39. Kaneko K, Abe K, Baba S, Tanabe Y, Yabuuchi H, Hatakenaka M, et al. Can calcification predict 131I accumulation on metastatic lymph nodes in papillary thyroid carcinoma patients receiving 131I therapy? Comparison of CT, 131I WBS and 18F-FDG PET/CT. Eur Radiol. 2010 Feb;20(2):477-83.
  40. Klein M, Catargi B. VEGF in physiological process and thyroid disease. Ann Endocrinol (Paris). 2007 Dec;68(6):438-48.
  41. Hall FT, Freeman JL, Asa SL, Jackson DG, Beasley NJ. Intratumoral lymphatics and lymph node metastases in papillary thyroid carcinoma. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 2003;129(7):716-9.
  42. Cheong H, Kang H, Kim HK, Bae JY, Song DE, Cho MS, et al. Microvessel and Lymphatic Vessel Density and VEGFR-3 Expression of Papillary Thyroid Carcinoma with Comparative Analysis of Clinicopathological Characteristics. Korean Journal of Pathology. 2010;44(3):243-51.
  43. Koo H, Cheong H. Microvessel and lymphatic vessel density and VEGFR-3 expression of papillary carcinoma of thyroid gland. Virchows Archiv. 2009;455:379-80.
  44. Matsumoto N, Mukae S, Tsuda H, Sawada A, Okazaki Y, Nagai K, et al. Prognostic value of LYVE-1-positive lymphatic vessel in tongue squamous cell carcinomas. Anticancer Res. 2010 Jun;30(6):1897-903.
  45. van Niekerk CG, Hulsbergen-van de Kaa CA, Barentsz JO, Witjes JA, van der Laak JA. Quantitative analysis of lymph vessel characteristics in organ confined prostate cancer. Prostate. 2010 Jul 14.
  46. Goyal S, Chauhan SK, El Annan J, Nallasamy N, Zhang Q, Dana R. Evidence of corneal lymphangiogenesis in dry eye disease: a potential link to adaptive immunity? Arch Ophthalmol. 2010 Jul;128(7):819-24.
  47. Chen D, Zheng J, Li H, Wang Q, Jiao X. Computer-assisted morphometric analysis of lymphatic vessel changes in hamster tongue carcinogenesis. J Oral Pathol Med. 2010 Aug 1;39(7):518-24.
  48. Girling JE, Donoghue JF, Lederman FL, Cann LM, Achen MG, Stacker SA, et al. Vascular endothelial growth factor-D over-expressing tumor cells induce differential effects on uterine vasculature in a mouse model of endometrial cancer. Reprod Biol Endocrinol. 2010;8:84.
  49. Heindl LM, Hofmann-Rummelt C, Adler W, Holbach LM, Naumann GO, Kruse FE, et al. Tumor-associated lymphangiogenesis in the development of conjunctival squamous cell carcinoma. Ophthalmology. 2010 Apr;117(4):649-58.
  50. Garcia EA, Simoes K, Wakamatsu A, Ressio RA, Alves VA, Longatto-Filho A, et al. Lymphatic vessel density and VEGF-C expression are significantly different among benign and malignant thyroid lesions. Endocr Pathol. 2010 Jun;21(2):101-7.
  51. Zhang L, Yankelevitz DF, Henschke CI, Reeves AP, Vazquez MF, Carter D. Variation in vascular distribution in small lung cancers. Lung Cancer. 2010 Jun;68(3):389-93.

УДК 616.44–006–078.4.
Работа выполнена в рамках проектов CRDF54028 и МНТЦ51682

Согласен Данный веб-сайт содержит информацию для специалистов в области медицины. В соответствии с действующим законодательством доступ к такой информации может быть предоставлен только медицинским и фармацевтическим работникам. Нажимая «Согласен», вы подтверждаете, что являетесь медицинским или фармацевтическим работником и берете на себя ответственность за последствия, вызванные возможным нарушением указанного ограничения. Информация на данном сайте не должна использоваться пациентами для самостоятельной диагностики и лечения и не может быть заменой очной консультации врача.

Сайт использует файлы cookies для более комфортной работы пользователя. Продолжая просмотр страниц сайта, вы соглашаетесь с использованием файлов cookies, а также с обработкой ваших персональных данных в соответствии с Политикой конфиденциальности.