Журнал
ONCOLOGY.RU

Патоморфология папиллярного рака щитовидной железы по данным обработки изображений, окрашенных маркером D2-40

М.В. Спринджук, А.П. Кончиц (к.б.н.)

Объединенный институт проблем информатики Национальной академии наук Беларуси, г. Минск, Беларусь


+375295671073

Аннотация. Рак щитовидной железы – болезнь, типичная для территории, загрязненной радиоактивными отходами. Цель исследования – изучение закономерностей роста и развития сети лимфатических сосудов папиллярных опухолей щитовидной железы на основании результатов обработки изображений патогистологических препаратов. Объектами исследования были микропрепараты, окрашенные маркером D2-40 (40 шт.). Препараты были приготовлены из хирургически удаленных опухолей (папиллярного рака щитовидной железы) пациентов, которым был установлен диагноз спорадического рака щитовидной железы. Образцы опухолей хранились в замороженном виде. Возраст больных варьировал от 9 до 18 лет, большинство пациентов имели женский пол (82,5%), средний размер опухоли составил 10 мм. Использовалось специально разработанное программное обеспечение, которое обрабатывало изображения и вычисляло 5 параметров: относительную площадь, занимаемую сосудами; однородность распределения сети в пространстве; относительную долю мелких объектов сосудов (шума); относительную долю крупных сосудов; среднее значение цветности выделяемых сосудов. Наблюдалась корреляция (Пирсона, Pearson correlation = 0,32) относительной площади лимфатических микрососудов с наличием инфильтративного роста опухоли щитовидной железы; значение двустороннего теста (Sig., 2-tailed) = 0,43; (P < 0,05). Основные идеи для дальнейшего развития темы: выделение субрегионов внутриопухолевой, околопухолевой, подкапсулярной зон опухоли щитовидной железы и съемка изображений в этих областях; применение робот-ассистированного сканирования всего препарата опухоли; разработка программного обеспечения для дифференциальной диагностики и классификации рака щитовидной железы на основании данных обработки изображений; поиск предсказательных факторов – параметров, полученных при процессинге изображений, для предвидения клинико-лабораторного состояния пациентов, перенесших операцию удаления щитовидной железы; выяснение значения относительной площади лимфатических сосудов и других параметров для принятия клинических решений, таких как назначения определенного режима химиотерапии или решения об объеме операции.

Ключевые слова: ангиогенез, лимфоангиогенез, рак щитовидной железы, опухоли, карцинома, плотность микрососудов, обработка изображений, программное обеспечение.

Key words: angiogenesis, lymphangiogenesis, thyroid gland cancer, tumor, carcinoma, density of microvessels, image processing software.



Введение: папиллярный рак щитовидной железы, общие сведения

Патологическая анатомия и гистология щитовидной железы изучается со времен изобретения средств и инструментов, предназначенных для этих целей. Наиболее ранние источники литературы, являющиеся фундаментом современных теоретических знаний, были опубликованы Hertzler A.E. [1] в 1936 году и De Courcy J.L., De Courcy C.B [2] в 1949 году.

Прогноз для папиллярного рака щитовидной железы вообще считают благоприятным; однако, это зависит от нескольких факторов риска, таких как возраст пациента; стадии распространения и гистологического дифференцирования. Летальность очень низкая (менее 6.5% по данным исследования отдаленных результатов лечения). Факторы риска развития папиллярного рака щитовидной железы включают предшествующее воздействие на организм атомной радиации (см. рис. 1-3), генетические заболевания и узловую (нодулярную) болезнь щитовидной железы [3].

Процентная гистограмма возраста больных папиллярным раком щитовидной железы по данным исследования

Рисунок 1. Процентная гистограмма возраста больных папиллярным раком щитовидной железы
по данным исследования, проведенного нами (age = возраст). Чаще встречался 15-летний возраст.


Препарат папиллярного рака щитовидной железы, наблюдается вовлечение окружающих лимфоузлов

Рисунок 2. Препарат папиллярного рака щитовидной железы,
наблюдается вовлечение окружающих лимфоузлов [3].


Тирозин-киназа рецептора Фактора Роста Эндотелия Сосудов человека

Рисунок 3. Тирозин-киназа рецептора Фактора Роста Эндотелия Сосудов человека
(рисунок из библиотеки программы «Слайды для науки», visiscience.com).


Визуализированные патоморфологические данные исследуемых опухолей

Рисунок 4. Визуализированные патоморфологические данные исследуемых опухолей.


Общие вопросы развития кровоснабжения и прогрессирования эндокринных опухолей

Рост опухоли, её системное воздействие на страдающий организм-хозяин, при условии несовершенства защитных сил организма, в конечном итоге приводит к гибели организма. Ангиогенез и лимфангиогенез как мишени лекарственных средств изучаются в связи с тем, что одна из основных современных гипотез канцерогенеза заключается в принятии во внимание фактов о том, что сосудистая сеть играет ведущую роль в обеспечении опухоли питательными веществами. Заметим, что изучаются патогенетические пути, радикально отличные от ангиогенетической концепции, поэтому можно считать, что канцерогенез – комплексный многогранный механизм, воздействие на который и составляет сущность лечения. Эндокринные железы и опухоли сами представляют собой генераторы биоактивных веществ, влияющих друг на друга и на ткани, соприкасающиеся напрямую или косвенно с кровеносным руслом организма-жертвы. Эти органы подвержены больше других воздействиям окружающей среды, состоянию других систем органов и тонко функционально взаимосвязаны с высшей нервной системой. Щитовидная железа – хорошо кровоснабжаемый орган, в котором гистологически наблюдается ярко выраженная сеть как кровеносных, так и лимфатических капилляров.

D2-40: Описание Маркера

D2-40 реагирует с O-связанным сиалогликопротеином (МВТ 40 КБ), найденным на лимфатическом эндотелии, эмбриональном яичке и на поверхности тестикулярных гермином. D2-40 – также новый селективный маркер лимфатического эндотелия в нормальных тканях и патологических сосудистых. Клон D2-40 показал окрашивание в эндотелии лимфангиом, тогда как гемангиомы, клубочковые опухоли, ангиолипомы, гнойные гранулемы и сосудистые пороки развития не демонстрировали окрашивания этим маркером. D2-40 также прокрашивает эндотелий саркомы Капоши и субпопуляции ангиосарком, а также является специфическим маркером для диагностики злокачественной мезотелиомы (см. рис. 4) [4].

Изображение патогистологического препарата папиллярного рака щитовидной железы после программной обработки

Рисунок 5. Изображение патогистологического препарата папиллярного рака щитовидной железы после программной обработки. Зелеными стрелками отмечены лимфатические капилляры, подсвеченные компьютерной программой черным цветом (увеличение х200).


Материалы и методы исследования

Исследование выполнялось по материалам Онкологического Диспансера г. Минска в течение 13 месяцев с 2009 по 2010 годы.

Критерии включения пациентов в исследование были следующие:

  1. больные дети были рождены позднее 1987 (по замыслу исследования, после аварии на ЧАЭС);
  2. все пациенты имели диагноз спорадического папиллярного рака щитовидной железы (на основе тонкоигольной биопсии и обследования удаленной опухоли);
  3. возраст варьировал от 9 до 18 лет;
  4. у всех больных не было признаков явной врожденной болезни и значительной сопутствующей патологии.

Программное обеспечение было написано на Delphi (то есть, фактически, объектно-ориентированном языке Паскаль) для операционной системы Windows. Ключевая функция программного обеспечения – вычисление прокрашенной коричневым цветом области гистологического изображения. Изображения были получены при помощи микроскопа «Leica DMD 108» с операционной системой Linux. Снимки были получены вручную, без сканера, 150 изображений, которые в основном визуально соответствовали области максимальной васкуляризации, были выбраны по зрительному оценочному решению одного исследователя как квадрат на увеличении х40, а затем сняты х200. Все изображения были сохранены в формате Tiff, приемлемом для программного обеспечения.

Программное обеспечение (см. рис. 6-9) произвело список числовых величин, который был импортирован в таблицу Excel.

Интересуемые ряды данных были адаптированы для программ SPSS 17, STAТA 9.1, NCSS2007&GESS2006, DeltaGraph, SAS_JMP, которыми были затем посчитаны корреляционные пары Пирсона с двусторонним критерием (тестом), и дисперсионный анализ (one-way ANOVA) для зависимых параметров: чисел, полученных путем обработки изображений, и ряда клинико-патоморфологичеких признаков (основные из них представлены на рис. 4).

Метод применяемого выделения (компьютерной сегментации) лимфатических сосудов с целью их дальнейшего количественного оценивания основан на анализе цветового пространства гистологического изображения.

Процедура выделения и анализа состоит из следующих этапов:

  1. Преобразование цветовых компонент R,G,B пикселей исходного изображения, представленного в цветовом пространстве RGB в соответствующие цветовых компоненты в цветовом пространстве HSL (Hue – цветность, Saturation – насыщенность, Luminosity – освещенность). Преобразование реализовано на основе известных аналитических выражений, отображающих R,G,B компоненты в H,S,L компоненты. В результате выполнения преобразования каждый пиксель изображения характеризуется тремя численными значениями H, S и L [5, 6].
  2. Выделение пикселей изображения, представляющих сосуды. Пиксель изображения считается принадлежащим сосуду, если его цветовые компоненты удовлетворяют следующему условию: H < 0.12 и L < 0.7.
  3. Удаление «шумовых» компонент изображения, к которым относятся объекты с площадью менее 7 пикселей.
  4. Анализ полученного в результате выполнения данной процедуры бинарного изображения лимфатической сети состоит в подсчете параметров, описывающих относительную площадь, занимаемую сосудами, однородность распределения сети в пространстве и относительную долю крупных сосудов.

Анализ полученного в результате выделения сосудов бинарного изображения лимфатической сети состоит в подсчете параметров, описывающих следующие свойства сети:

  1. Относительную площадь, занимаемую сосудами, S (ОПЗС). Общая сумма пикселей сосудов делится на совокупное количество пикселей изображения. В тексте статьи, ПЛК и ОПЛС (относительная площадь лимфатических сосудов)– синонимы ОПЗС.
  2. Однородность (homogeneity, Hm) распределения сети в пространстве. Все изображение разбивается на 100х100 одинаковых фрагментов, затем определяется степень равномерности распределения выделенных пикселей по этим фрагментам. В данном случае определяется энтропия Н = -ΣPi*ln(Pi), где Pi – частота (вероятность) попадания пикселя в i-тый фрагмент. Величина изменяется от 0 – все в одном фрагменте, до 1 – равномерное распределение по всем фрагментам (пронормирована).
  3. Относительную долю мелких объектов сосудов (шума), Ns, (ОДМОС). На бинарном изображении удаляются граничные пиксели (в анализе изображений это называется эрозия). Затем находится отношение площади сосудов нового изображения к площади сосудов исходного изображения. Величина изменяется от 0 (все сосуды мелкие, не соединяющиеся) до 1 гистологическое изображение не содержит «шум».
  4. Относительную долю крупных сосудов (Ns1, ОДКС). На бинарном изображении многократно (6 раз) удаляются граничные пиксели. Находится отношение площади сосудов нового изображения к площади сосудов исходного изображения. Величина изменяется от 0 до 1 – крупные сосуды.
  5. Дополнительно (по исходному изображению) определяется среднее значение цветности выделяемых сосудов, СЗЦВС, (см. рис. 7, 8).

Интерфейс программы, разработанной для количественной оценки русла лимфатических капилляров в щитовидной железе

Рисунок 6. Интерфейс программы, разработанной для количественной оценки русла лимфатических капилляров в щитовидной железе. Программа считает пакет изображений в указанной директории. Можно одновременно запускать до 10 программ.


График, демонстрирующий общее сравнение и взаимосвязи численных значений параметров изображений

Рисунок 7. График, демонстрирующий общее сравнение и взаимосвязи численных значений параметров изображений.


Графики, иллюстрирующие сравнение значений параметров изображений 40 опухолевых образцов

A)

Графики, иллюстрирующие сравнение значений параметров изображений 40 опухолевых образцов

Б)

Рисунок 8. Графики, иллюстрирующие сравнение значений параметров изображений 40 опухолевых образцов. На графике A, по оси х – значения относительной площади, занимаемой сосудами, у – доли единицы. Однородность – наиболее вариабельный параметр.


График, показывающий пределы значений площади сосудов при наличии (1) и отсутствии (0) инфильтративного роста опухоли

Рисунок 9. График, показывающий пределы значений площади сосудов при наличии (1) и отсутствии (0) инфильтративного роста опухоли. Инфильтративный рост ассоциировался с большими значениями площади сосудов.


Распределение половой принадлежности пациентов

Рисунок 10. Распределение половой принадлежности пациентов.


Распределение размеров опухоли

Рисунок 11. Распределение размеров опухоли.
По оси абсцисс – размер в мм, по оси ординат – проценты.


TNM распределение изучаемых опухолевых препаратов

Рисунок 12. TNM распределение изучаемых опухолевых препаратов
(по оси ординат – проценты).


Результаты исследования

Наше исследование было сфокусировано не на всестороннем анализе патоморфологии рака щитовидной железы, о которой немало написано [7-16], а на выявлении возможностей обработки изображений для изучения сети лимфатических капилляров. Мы под инфильтративным ростом понимаем диффузное распространение опухоли путем проникновения в окружающие ткани через стадию образования скоплений клеток-инфильтратов. Общеизвестно, что помимо этого типа различают также экспансивный и тотальный рост опухоли, можно предположить, что паттерн роста опухоли может меняться.

Единственным клинико-морфологическим показателем, который четко и статистически значимо ассоциировался с числовыми значениями параметров, полученных после обработки изображений опухолей, был инфильтративный рост опухоли (см. рис. 4, 9). Наблюдалась корреляция (Пирсона, Pearson correlation = 0,32) относительной площади лимфатических микрососудов с этим параметром; значение двустороннего теста (Sig., 2-tailed) = 0,43; (P < 0,05). Результаты вычислений дисперсионного анализа параметров, полученных при обработке изображений как зависимых, и патоморфологических признаков как независимых, подтвердили закономерность, выявленную при анализе корреляционного матрикса Пирсона. Аналогичного исследования на группе пациентов с такими характеристиками (см. рис. 1, 4, 10-12) никогда ранее не проводилось, и упоминаний в литературе, касающейся компьютер-ассистированного изучения препаратов лимфангиогенеза, таких данных нет [17-26].

Выводы и заключение

Основной результат исследования – обнаружение зависимости между инфильтративным ростом папиллярных карцином щитовидной железы и относительной площадью капиллярного лимфатического русла, измеренной на цифровых изображениях. Очевидные ограничения нашего исследования это: а) малое количество пациентов; б) применение только одной компьютерной программы для обработки изображений и не использование гратикулы-сетки Chalkley; в) неоднородность пациентов; г) применение только одного иммунохимического маркера; д) использование неавтоматизированного субъективного выбора зон съемки изображений. Заметим, что эти проблемы преодолимы только при осуществлении дорогостоящего широкомасштабного исследования.

Идеи для дальнейших исследований явлений опухолевого ангио- и лимфангиогенеза:

  • выделение субрегионов внутриопухолевой, околоопухолевой, подкапсулярной зон опухоли щитовидной железы и съемка изображений в этих зонах;
  • применение робот-ассистированного сканирования поверхности всего препарата опухоли;
  • изучение паттернов ангиогенеза в тканях организмов, подвергшихся радиации и действию отравляющих веществ, с целью поиска мишени воздействия радио – и токсо-протекторов и противоопухолевых медикаментов;
  • разработка программного обеспечения для дифференциальной диагностики и классификации рака щитовидной железы на основании данных обработки изображений;
  • поиск предсказательных факторов – параметров, полученных при процессинге изображений, для предвидения клинико-лабораторного состояния пациентов, перенесших операцию удаления щитовидной железы;
  • выяснение значения относительной площади лимфатических сосудов и других параметров для принятия клинических решений, таких как назначения определенного режима химиотерапии или решения об объеме операции.

Подчеркнем, что эти мысли о дальнейшей научной работе происходят не из пустоты воображения, а из опыта исследователей ангиогенеза в органах, отличных от щитовидной железы [27-32].

Литература

  1. Hertzler AE. Surgical pathology of the thyroid gland [print]. Philadelphia: J.B. Lippincott Co.; 1936.
  2. De Courcy JL, De Courcy CB. Pathology and surgery of thyroid disease [print]. Springfield, IL: C.C. Thomas; 1949.
  3. Kini SR. Thyroid cytopathology [print] : an atlas and text. [1st ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2008.
  4. Tanda F, Massarelli G, Bosincu L, Cossu A. Angiosarcoma of the thyroid: a light, electron microscopic and histoimmunological study. Hum Pathol. 1988 Jun;19(6):742-5.
  5. http://ru.wikipedia.org/wiki/HSL.
  6. Гонсалес Р, Вудс Р. Цифровая обработка изображений. Москва: Техносфера; 2005.
  7. Abrosimov A. [Thyroid cancer with cribriform-morular structures: the problems of morphology and classification]. Arkh Patol. 2008 Mar-Apr;70(2):18-21.
  8. Kroll TG. Molecular rearrangements and morphology in thyroid cancer. Am J Pathol. 2002 Jun;160(6):1941-4.
  9. Schroder S, Baisch H, Rehpenning W, Muller-Gartner HW, Schulz-Bischof K, Sablotny B, et al. [Morphology and prognosis of follicular thyroid cancer-a clinico-pathologic and DNA cytometric study of 95 tumors]. Langenbecks Arch Chir. 1987;370(1):3-24.
  10. Meng W, Lorenz G. [Morphology and clinical picture of thyroid cancer]. Z Arztl Fortbild (Jena). 1983;77(15):635-8.
  11. Fagin JA, Mitsiades N. Molecular pathology of thyroid cancer: diagnostic and clinical implications. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2008 Dec;22(6):955-69.
  12. Reiners C, Demidchik YE. Differentiated thyroid cancer in childhood: pathology, diagnosis, therapy. Pediatr Endocrinol Rev. 2003 Dec;1 Suppl 2:230-5; discussion 5-6.
  13. Asa SL. The pathology of thyroid cancer. Cancer Treat Res. 2004;122:23-67.
  14. Squartini F, Di Coscio GC. [Pathology and morphological diagnosis of thyroid cancer: current aspects, results and problems]. Minerva Med. 1986 Nov 17;77(44):2045-8.
  15. Barney PL. Pathology of thyroid cancer: summary and update. Laryngoscope. 1984 Apr;94(4):525-7.
  16. Farooki MA. Epidemiology and pathology of cancer of the thyroid. 2. Discussion. Int Surg. 1969 Apr;51(4):317-33.
  17. de la Torre NG, Buley I, Wass JA, Turner HE. Angiogenesis and lymphangiogenesis in thyroid proliferative lesions: relationship to type and tumour behaviour. Endocr Relat Cancer. 2006 Sep;13(3):931-44.
  18. Liang QC, Wei QY, Fan SQ. [Expression of VEGF-C and angiogenesis, and lymphangiogenesis in papillary thyroid carcinoma]. Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2006 Jun;31(3):414-6, 9.
  19. Furtado GC, Marinkovic T, Martin AP, Garin A, Hoch B, Hubner W, et al. Lymphotoxin beta receptor signaling is required for inflammatory lymphangiogenesis in the thyroid. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Mar 20;104(12):5026-31.
  20. Deng HJ, Huang XC, Han SL, Ding GP. [Relationship between micro-lymphatic vessel density and lymphatic metastasis in follicular thyroid carcinoma]. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 2009 Jun;25(6):519-21.
  21. Garcia EA, Simoes K, Wakamatsu A, Ressio RA, Alves VA, Longatto-Filho A, et al. Lymphatic vessel density and VEGF-C expression are significantly different among benign and malignant thyroid lesions. Endocr Pathol. Jun;21(2):101-7.
  22. Giorgadze TA, Baloch ZW, Pasha T, Zhang PJ, Livolsi VA. Lymphatic and blood vessel density in the follicular patterned lesions of thyroid. Mod Pathol. 2005 Nov;18(11):1424-31.
  23. Hall FT, Freeman JL, Asa SL, Jackson DG, Beasley NJ. Intratumoral lymphatics and lymph node metastases in papillary thyroid carcinoma. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 2003 Jul;129(7):716-9.
  24. Harin Cheong HK, ∙ Hyung Kyung Kim∙Ji, Yoon Bae,∙ Dong Eun Song∙,Min Sun Cho,∙Sun Hee Sung,∙Woon Sup, Han∙Heasoo Koo. Microvessel and Lymphatic Vessel Density and VEGFR-3 Expression of Papillary Thyroid Carcinoma with Comparative Analysis of Clinicopathological Characteristics. The Korean Journal of Pathology. 2010;44(3):243-51.
  25. Lin X, Zhu B, Liu Y, Silverman JF. Follicular thyroid carcinoma invades venous rather than lymphatic vessels. Diagn Pathol.5:8.
  26. Van der Auwera I, Cao Y, Tille JC, Pepper MS, Jackson DG, Fox SB, et al. First international consensus on the methodology of lymphangiogenesis quantification in solid human tumours. Br J Cancer. 2006 Dec 18;95(12):1611-25.
  27. Cao Y. Why and how do tumors stimulate lymphangiogenesis? Lymphat Res Biol. 2008;6(3-4):145-8.
  28. Gao Y, Zhong WX, Mu DB, Yuan YP, Zhang YH, Yu JM, et al. Distributions of angiogenesis and lymphangiogenesis in gastrointestinal intramucosal tumors. Ann Surg Oncol. 2008 Apr;15(4):1117-23.
  29. Sipos B, Klapper W, Kruse ML, Kalthoff H, Kerjaschki D, Kloppel G. Expression of lymphangiogenic factors and evidence of intratumoral lymphangiogenesis in pancreatic endocrine tumors. Am J Pathol. 2004 Oct;165(4):1187-97.
  30. Jain RK. Angiogenesis and lymphangiogenesis in tumors: insights from intravital microscopy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2002;67:239-48.
  31. Reis-Filho JS, Schmitt FC. Lymphangiogenesis in tumors: what do we know? Microsc Res Tech. 2003 Feb 1;60(2):171-80.
  32. Mattila MM, Ruohola JK, Karpanen T, Jackson DG, Alitalo K, Harkonen PL. VEGF-C induced lymphangiogenesis is associated with lymph node metastasis in orthotopic MCF-7 tumors. Int J Cancer. 2002 Apr 20;98(6):946-51.

Ссылки на полезные источники и программное обеспечение для науки:

фУДК 616.44–006–078.4.
Работа выполнена в рамках проектов CRDF-4028 и МНТЦ-1682

Согласен Данный веб-сайт содержит информацию для специалистов в области медицины. В соответствии с действующим законодательством доступ к такой информации может быть предоставлен только медицинским и фармацевтическим работникам. Нажимая «Согласен», вы подтверждаете, что являетесь медицинским или фармацевтическим работником и берете на себя ответственность за последствия, вызванные возможным нарушением указанного ограничения. Информация на данном сайте не должна использоваться пациентами для самостоятельной диагностики и лечения и не может быть заменой очной консультации врача.

Сайт использует файлы cookies для более комфортной работы пользователя. Продолжая просмотр страниц сайта, вы соглашаетесь с использованием файлов cookies, а также с обработкой ваших персональных данных в соответствии с Политикой конфиденциальности.