Патоморфология папиллярного рака щитовидной железы по данным обработки изображений, окрашенных маркером D2-40
М.В. Спринджук, А.П. Кончиц (к.б.н.)
Объединенный институт проблем информатики Национальной академии наук Беларуси, г. Минск, Беларусь
+375295671073
Аннотация. Рак щитовидной железы – болезнь, типичная для территории, загрязненной радиоактивными отходами. Цель исследования – изучение закономерностей роста и развития сети лимфатических сосудов папиллярных опухолей щитовидной железы на основании результатов обработки изображений патогистологических препаратов. Объектами исследования были микропрепараты, окрашенные маркером D2-40 (40 шт.). Препараты были приготовлены из хирургически удаленных опухолей (папиллярного рака щитовидной железы) пациентов, которым был установлен диагноз спорадического рака щитовидной железы. Образцы опухолей хранились в замороженном виде. Возраст больных варьировал от 9 до 18 лет, большинство пациентов имели женский пол (82,5%), средний размер опухоли составил 10 мм. Использовалось специально разработанное программное обеспечение, которое обрабатывало изображения и вычисляло 5 параметров: относительную площадь, занимаемую сосудами; однородность распределения сети в пространстве; относительную долю мелких объектов сосудов (шума); относительную долю крупных сосудов; среднее значение цветности выделяемых сосудов. Наблюдалась корреляция (Пирсона, Pearson correlation = 0,32) относительной площади лимфатических микрососудов с наличием инфильтративного роста опухоли щитовидной железы; значение двустороннего теста (Sig., 2-tailed) = 0,43; (P < 0,05). Основные идеи для дальнейшего развития темы: выделение субрегионов внутриопухолевой, околопухолевой, подкапсулярной зон опухоли щитовидной железы и съемка изображений в этих областях; применение робот-ассистированного сканирования всего препарата опухоли; разработка программного обеспечения для дифференциальной диагностики и классификации рака щитовидной железы на основании данных обработки изображений; поиск предсказательных факторов – параметров, полученных при процессинге изображений, для предвидения клинико-лабораторного состояния пациентов, перенесших операцию удаления щитовидной железы; выяснение значения относительной площади лимфатических сосудов и других параметров для принятия клинических решений, таких как назначения определенного режима химиотерапии или решения об объеме операции.
Ключевые слова: ангиогенез, лимфоангиогенез, рак щитовидной железы, опухоли, карцинома, плотность микрососудов, обработка изображений, программное обеспечение.
Key words: angiogenesis, lymphangiogenesis, thyroid gland cancer, tumor, carcinoma, density of microvessels, image processing software.
Введение: папиллярный рак щитовидной железы, общие сведения
Патологическая анатомия и гистология щитовидной железы изучается со времен изобретения средств и инструментов, предназначенных для этих целей. Наиболее ранние источники литературы, являющиеся фундаментом современных теоретических знаний, были опубликованы Hertzler A.E. [1] в 1936 году и De Courcy J.L., De Courcy C.B [2] в 1949 году.
Прогноз для папиллярного рака щитовидной железы вообще считают благоприятным; однако, это зависит от нескольких факторов риска, таких как возраст пациента; стадии распространения и гистологического дифференцирования. Летальность очень низкая (менее 6.5% по данным исследования отдаленных результатов лечения). Факторы риска развития папиллярного рака щитовидной железы включают предшествующее воздействие на организм атомной радиации (см. рис. 1-3), генетические заболевания и узловую (нодулярную) болезнь щитовидной железы [3].
Рисунок 1. Процентная гистограмма возраста больных папиллярным раком щитовидной железы
по данным исследования, проведенного нами (age = возраст). Чаще встречался 15-летний возраст.
Рисунок 2. Препарат папиллярного рака щитовидной железы,
наблюдается вовлечение окружающих лимфоузлов [3].
Рисунок 3. Тирозин-киназа рецептора Фактора Роста Эндотелия Сосудов человека
(рисунок из библиотеки программы «Слайды для науки», visiscience.com).
Рисунок 4. Визуализированные патоморфологические данные исследуемых опухолей.
Общие вопросы развития кровоснабжения и прогрессирования эндокринных опухолей
Рост опухоли, её системное воздействие на страдающий организм-хозяин, при условии несовершенства защитных сил организма, в конечном итоге приводит к гибели организма. Ангиогенез и лимфангиогенез как мишени лекарственных средств изучаются в связи с тем, что одна из основных современных гипотез канцерогенеза заключается в принятии во внимание фактов о том, что сосудистая сеть играет ведущую роль в обеспечении опухоли питательными веществами. Заметим, что изучаются патогенетические пути, радикально отличные от ангиогенетической концепции, поэтому можно считать, что канцерогенез – комплексный многогранный механизм, воздействие на который и составляет сущность лечения. Эндокринные железы и опухоли сами представляют собой генераторы биоактивных веществ, влияющих друг на друга и на ткани, соприкасающиеся напрямую или косвенно с кровеносным руслом организма-жертвы. Эти органы подвержены больше других воздействиям окружающей среды, состоянию других систем органов и тонко функционально взаимосвязаны с высшей нервной системой. Щитовидная железа – хорошо кровоснабжаемый орган, в котором гистологически наблюдается ярко выраженная сеть как кровеносных, так и лимфатических капилляров.
D2-40: Описание Маркера
D2-40 реагирует с O-связанным сиалогликопротеином (МВТ 40 КБ), найденным на лимфатическом эндотелии, эмбриональном яичке и на поверхности тестикулярных гермином. D2-40 – также новый селективный маркер лимфатического эндотелия в нормальных тканях и патологических сосудистых. Клон D2-40 показал окрашивание в эндотелии лимфангиом, тогда как гемангиомы, клубочковые опухоли, ангиолипомы, гнойные гранулемы и сосудистые пороки развития не демонстрировали окрашивания этим маркером. D2-40 также прокрашивает эндотелий саркомы Капоши и субпопуляции ангиосарком, а также является специфическим маркером для диагностики злокачественной мезотелиомы (см. рис. 4) [4].
Рисунок 5. Изображение патогистологического препарата папиллярного рака щитовидной железы после программной обработки. Зелеными стрелками отмечены лимфатические капилляры, подсвеченные компьютерной программой черным цветом (увеличение х200).
Материалы и методы исследования
Исследование выполнялось по материалам Онкологического Диспансера г. Минска в течение 13 месяцев с 2009 по 2010 годы.
Критерии включения пациентов в исследование были следующие:
- больные дети были рождены позднее 1987 (по замыслу исследования, после аварии на ЧАЭС);
- все пациенты имели диагноз спорадического папиллярного рака щитовидной железы (на основе тонкоигольной биопсии и обследования удаленной опухоли);
- возраст варьировал от 9 до 18 лет;
- у всех больных не было признаков явной врожденной болезни и значительной сопутствующей патологии.
Программное обеспечение было написано на Delphi (то есть, фактически, объектно-ориентированном языке Паскаль) для операционной системы Windows. Ключевая функция программного обеспечения – вычисление прокрашенной коричневым цветом области гистологического изображения. Изображения были получены при помощи микроскопа «Leica DMD 108» с операционной системой Linux. Снимки были получены вручную, без сканера, 150 изображений, которые в основном визуально соответствовали области максимальной васкуляризации, были выбраны по зрительному оценочному решению одного исследователя как квадрат на увеличении х40, а затем сняты х200. Все изображения были сохранены в формате Tiff, приемлемом для программного обеспечения.
Программное обеспечение (см. рис. 6-9) произвело список числовых величин, который был импортирован в таблицу Excel.
Интересуемые ряды данных были адаптированы для программ SPSS 17, STAТA 9.1, NCSS2007&GESS2006, DeltaGraph, SAS_JMP, которыми были затем посчитаны корреляционные пары Пирсона с двусторонним критерием (тестом), и дисперсионный анализ (one-way ANOVA) для зависимых параметров: чисел, полученных путем обработки изображений, и ряда клинико-патоморфологичеких признаков (основные из них представлены на рис. 4).
Метод применяемого выделения (компьютерной сегментации) лимфатических сосудов с целью их дальнейшего количественного оценивания основан на анализе цветового пространства гистологического изображения.
Процедура выделения и анализа состоит из следующих этапов:
- Преобразование цветовых компонент R,G,B пикселей исходного изображения, представленного в цветовом пространстве RGB в соответствующие цветовых компоненты в цветовом пространстве HSL (Hue – цветность, Saturation – насыщенность, Luminosity – освещенность). Преобразование реализовано на основе известных аналитических выражений, отображающих R,G,B компоненты в H,S,L компоненты. В результате выполнения преобразования каждый пиксель изображения характеризуется тремя численными значениями H, S и L [5, 6].
- Выделение пикселей изображения, представляющих сосуды. Пиксель изображения считается принадлежащим сосуду, если его цветовые компоненты удовлетворяют следующему условию: H < 0.12 и L < 0.7.
- Удаление «шумовых» компонент изображения, к которым относятся объекты с площадью менее 7 пикселей.
- Анализ полученного в результате выполнения данной процедуры бинарного изображения лимфатической сети состоит в подсчете параметров, описывающих относительную площадь, занимаемую сосудами, однородность распределения сети в пространстве и относительную долю крупных сосудов.
Анализ полученного в результате выделения сосудов бинарного изображения лимфатической сети состоит в подсчете параметров, описывающих следующие свойства сети:
- Относительную площадь, занимаемую сосудами, S (ОПЗС). Общая сумма пикселей сосудов делится на совокупное количество пикселей изображения. В тексте статьи, ПЛК и ОПЛС (относительная площадь лимфатических сосудов)– синонимы ОПЗС.
- Однородность (homogeneity, Hm) распределения сети в пространстве. Все изображение разбивается на 100х100 одинаковых фрагментов, затем определяется степень равномерности распределения выделенных пикселей по этим фрагментам. В данном случае определяется энтропия Н = -ΣPi*ln(Pi), где Pi – частота (вероятность) попадания пикселя в i-тый фрагмент. Величина изменяется от 0 – все в одном фрагменте, до 1 – равномерное распределение по всем фрагментам (пронормирована).
- Относительную долю мелких объектов сосудов (шума), Ns, (ОДМОС). На бинарном изображении удаляются граничные пиксели (в анализе изображений это называется эрозия). Затем находится отношение площади сосудов нового изображения к площади сосудов исходного изображения. Величина изменяется от 0 (все сосуды мелкие, не соединяющиеся) до 1 гистологическое изображение не содержит «шум».
- Относительную долю крупных сосудов (Ns1, ОДКС). На бинарном изображении многократно (6 раз) удаляются граничные пиксели. Находится отношение площади сосудов нового изображения к площади сосудов исходного изображения. Величина изменяется от 0 до 1 – крупные сосуды.
- Дополнительно (по исходному изображению) определяется среднее значение цветности выделяемых сосудов, СЗЦВС, (см. рис. 7, 8).
Рисунок 6. Интерфейс программы, разработанной для количественной оценки русла лимфатических капилляров в щитовидной железе. Программа считает пакет изображений в указанной директории. Можно одновременно запускать до 10 программ.
Рисунок 7. График, демонстрирующий общее сравнение и взаимосвязи численных значений параметров изображений.
A)
Б)
Рисунок 8. Графики, иллюстрирующие сравнение значений параметров изображений 40 опухолевых образцов. На графике A, по оси х – значения относительной площади, занимаемой сосудами, у – доли единицы. Однородность – наиболее вариабельный параметр.
Рисунок 9. График, показывающий пределы значений площади сосудов при наличии (1) и отсутствии (0) инфильтративного роста опухоли. Инфильтративный рост ассоциировался с большими значениями площади сосудов.
Рисунок 10. Распределение половой принадлежности пациентов.
Рисунок 11. Распределение размеров опухоли.
По оси абсцисс – размер в мм, по оси ординат – проценты.
Рисунок 12. TNM распределение изучаемых опухолевых препаратов
(по оси ординат – проценты).
Результаты исследования
Наше исследование было сфокусировано не на всестороннем анализе патоморфологии рака щитовидной железы, о которой немало написано [7-16], а на выявлении возможностей обработки изображений для изучения сети лимфатических капилляров. Мы под инфильтративным ростом понимаем диффузное распространение опухоли путем проникновения в окружающие ткани через стадию образования скоплений клеток-инфильтратов. Общеизвестно, что помимо этого типа различают также экспансивный и тотальный рост опухоли, можно предположить, что паттерн роста опухоли может меняться.
Единственным клинико-морфологическим показателем, который четко и статистически значимо ассоциировался с числовыми значениями параметров, полученных после обработки изображений опухолей, был инфильтративный рост опухоли (см. рис. 4, 9). Наблюдалась корреляция (Пирсона, Pearson correlation = 0,32) относительной площади лимфатических микрососудов с этим параметром; значение двустороннего теста (Sig., 2-tailed) = 0,43; (P < 0,05). Результаты вычислений дисперсионного анализа параметров, полученных при обработке изображений как зависимых, и патоморфологических признаков как независимых, подтвердили закономерность, выявленную при анализе корреляционного матрикса Пирсона. Аналогичного исследования на группе пациентов с такими характеристиками (см. рис. 1, 4, 10-12) никогда ранее не проводилось, и упоминаний в литературе, касающейся компьютер-ассистированного изучения препаратов лимфангиогенеза, таких данных нет [17-26].
Выводы и заключение
Основной результат исследования – обнаружение зависимости между инфильтративным ростом папиллярных карцином щитовидной железы и относительной площадью капиллярного лимфатического русла, измеренной на цифровых изображениях. Очевидные ограничения нашего исследования это: а) малое количество пациентов; б) применение только одной компьютерной программы для обработки изображений и не использование гратикулы-сетки Chalkley; в) неоднородность пациентов; г) применение только одного иммунохимического маркера; д) использование неавтоматизированного субъективного выбора зон съемки изображений. Заметим, что эти проблемы преодолимы только при осуществлении дорогостоящего широкомасштабного исследования.
Идеи для дальнейших исследований явлений опухолевого ангио- и лимфангиогенеза:
- выделение субрегионов внутриопухолевой, околоопухолевой, подкапсулярной зон опухоли щитовидной железы и съемка изображений в этих зонах;
- применение робот-ассистированного сканирования поверхности всего препарата опухоли;
- изучение паттернов ангиогенеза в тканях организмов, подвергшихся радиации и действию отравляющих веществ, с целью поиска мишени воздействия радио – и токсо-протекторов и противоопухолевых медикаментов;
- разработка программного обеспечения для дифференциальной диагностики и классификации рака щитовидной железы на основании данных обработки изображений;
- поиск предсказательных факторов – параметров, полученных при процессинге изображений, для предвидения клинико-лабораторного состояния пациентов, перенесших операцию удаления щитовидной железы;
- выяснение значения относительной площади лимфатических сосудов и других параметров для принятия клинических решений, таких как назначения определенного режима химиотерапии или решения об объеме операции.
Подчеркнем, что эти мысли о дальнейшей научной работе происходят не из пустоты воображения, а из опыта исследователей ангиогенеза в органах, отличных от щитовидной железы [27-32].
Литература
- Hertzler AE. Surgical pathology of the thyroid gland [print]. Philadelphia: J.B. Lippincott Co.; 1936.
- De Courcy JL, De Courcy CB. Pathology and surgery of thyroid disease [print]. Springfield, IL: C.C. Thomas; 1949.
- Kini SR. Thyroid cytopathology [print] : an atlas and text. [1st ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2008.
- Tanda F, Massarelli G, Bosincu L, Cossu A. Angiosarcoma of the thyroid: a light, electron microscopic and histoimmunological study. Hum Pathol. 1988 Jun;19(6):742-5.
- http://ru.wikipedia.org/wiki/HSL.
- Гонсалес Р, Вудс Р. Цифровая обработка изображений. Москва: Техносфера; 2005.
- Abrosimov A. [Thyroid cancer with cribriform-morular structures: the problems of morphology and classification]. Arkh Patol. 2008 Mar-Apr;70(2):18-21.
- Kroll TG. Molecular rearrangements and morphology in thyroid cancer. Am J Pathol. 2002 Jun;160(6):1941-4.
- Schroder S, Baisch H, Rehpenning W, Muller-Gartner HW, Schulz-Bischof K, Sablotny B, et al. [Morphology and prognosis of follicular thyroid cancer-a clinico-pathologic and DNA cytometric study of 95 tumors]. Langenbecks Arch Chir. 1987;370(1):3-24.
- Meng W, Lorenz G. [Morphology and clinical picture of thyroid cancer]. Z Arztl Fortbild (Jena). 1983;77(15):635-8.
- Fagin JA, Mitsiades N. Molecular pathology of thyroid cancer: diagnostic and clinical implications. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2008 Dec;22(6):955-69.
- Reiners C, Demidchik YE. Differentiated thyroid cancer in childhood: pathology, diagnosis, therapy. Pediatr Endocrinol Rev. 2003 Dec;1 Suppl 2:230-5; discussion 5-6.
- Asa SL. The pathology of thyroid cancer. Cancer Treat Res. 2004;122:23-67.
- Squartini F, Di Coscio GC. [Pathology and morphological diagnosis of thyroid cancer: current aspects, results and problems]. Minerva Med. 1986 Nov 17;77(44):2045-8.
- Barney PL. Pathology of thyroid cancer: summary and update. Laryngoscope. 1984 Apr;94(4):525-7.
- Farooki MA. Epidemiology and pathology of cancer of the thyroid. 2. Discussion. Int Surg. 1969 Apr;51(4):317-33.
- de la Torre NG, Buley I, Wass JA, Turner HE. Angiogenesis and lymphangiogenesis in thyroid proliferative lesions: relationship to type and tumour behaviour. Endocr Relat Cancer. 2006 Sep;13(3):931-44.
- Liang QC, Wei QY, Fan SQ. [Expression of VEGF-C and angiogenesis, and lymphangiogenesis in papillary thyroid carcinoma]. Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2006 Jun;31(3):414-6, 9.
- Furtado GC, Marinkovic T, Martin AP, Garin A, Hoch B, Hubner W, et al. Lymphotoxin beta receptor signaling is required for inflammatory lymphangiogenesis in the thyroid. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Mar 20;104(12):5026-31.
- Deng HJ, Huang XC, Han SL, Ding GP. [Relationship between micro-lymphatic vessel density and lymphatic metastasis in follicular thyroid carcinoma]. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 2009 Jun;25(6):519-21.
- Garcia EA, Simoes K, Wakamatsu A, Ressio RA, Alves VA, Longatto-Filho A, et al. Lymphatic vessel density and VEGF-C expression are significantly different among benign and malignant thyroid lesions. Endocr Pathol. Jun;21(2):101-7.
- Giorgadze TA, Baloch ZW, Pasha T, Zhang PJ, Livolsi VA. Lymphatic and blood vessel density in the follicular patterned lesions of thyroid. Mod Pathol. 2005 Nov;18(11):1424-31.
- Hall FT, Freeman JL, Asa SL, Jackson DG, Beasley NJ. Intratumoral lymphatics and lymph node metastases in papillary thyroid carcinoma. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 2003 Jul;129(7):716-9.
- Harin Cheong HK, ∙ Hyung Kyung Kim∙Ji, Yoon Bae,∙ Dong Eun Song∙,Min Sun Cho,∙Sun Hee Sung,∙Woon Sup, Han∙Heasoo Koo. Microvessel and Lymphatic Vessel Density and VEGFR-3 Expression of Papillary Thyroid Carcinoma with Comparative Analysis of Clinicopathological Characteristics. The Korean Journal of Pathology. 2010;44(3):243-51.
- Lin X, Zhu B, Liu Y, Silverman JF. Follicular thyroid carcinoma invades venous rather than lymphatic vessels. Diagn Pathol.5:8.
- Van der Auwera I, Cao Y, Tille JC, Pepper MS, Jackson DG, Fox SB, et al. First international consensus on the methodology of lymphangiogenesis quantification in solid human tumours. Br J Cancer. 2006 Dec 18;95(12):1611-25.
- Cao Y. Why and how do tumors stimulate lymphangiogenesis? Lymphat Res Biol. 2008;6(3-4):145-8.
- Gao Y, Zhong WX, Mu DB, Yuan YP, Zhang YH, Yu JM, et al. Distributions of angiogenesis and lymphangiogenesis in gastrointestinal intramucosal tumors. Ann Surg Oncol. 2008 Apr;15(4):1117-23.
- Sipos B, Klapper W, Kruse ML, Kalthoff H, Kerjaschki D, Kloppel G. Expression of lymphangiogenic factors and evidence of intratumoral lymphangiogenesis in pancreatic endocrine tumors. Am J Pathol. 2004 Oct;165(4):1187-97.
- Jain RK. Angiogenesis and lymphangiogenesis in tumors: insights from intravital microscopy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2002;67:239-48.
- Reis-Filho JS, Schmitt FC. Lymphangiogenesis in tumors: what do we know? Microsc Res Tech. 2003 Feb 1;60(2):171-80.
- Mattila MM, Ruohola JK, Karpanen T, Jackson DG, Alitalo K, Harkonen PL. VEGF-C induced lymphangiogenesis is associated with lymph node metastasis in orthotopic MCF-7 tumors. Int J Cancer. 2002 Apr 20;98(6):946-51.
Ссылки на полезные источники и программное обеспечение для науки:
- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/
- http://en.wikipedia.org/wiki/Reference_management_software
- http://download.cnet.com/Viper-the-Anti-plagiarism-Scanner/3000-2051_4-10795356.html
- http://download.cnet.com/AntiPlagiarism/3000-2073_4-10454033.html?tag=mncol;1
- http://www.brothersoft.com/plagiarism-finder-29261.html
- http://www.brothersoft.com/plagiarism-detector-153977.html
- http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_statistical_packages
- http://en.wikipedia.org/wiki/Computer-assisted_translation#Comparison_of_different_CAT_tools
фУДК 616.44–006–078.4.
Работа выполнена в рамках проектов CRDF-4028 и МНТЦ-1682