Противоопухолевые свойства
лектинов омелы белой
Д.Б. Корман
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН
Среди огромного разнообразия средств, используемых в лекарственной альтернативной терапии рака, особое внимание привлекает ряд препаратов, имеющих устойчивый спрос на протяжении десятилетий, до настоящего времени широко применяемых врачами и больными, но, тем не менее, не вошедших в число конвенциальных лекарственных средств.
Вероятно, это обусловлено рядом фактором. Во-первых, эти препараты природного происхождения, имеют сложный композиционный состав и, как следствие, их трудно стандартизовать. Их активность и токсичность зависит от технологии получения исходного сырья, технологии приготовления лекарственных форм разными производителями. Во-вторых, в течение длительного времени попытки экспериментально обосновать противоопухолевую активность этих препаратов, как правило, были малоубедительными. Возможно, что к препаратам такого рода вообще не применимы стандартные модели скрининга веществ на противоопухолевую активность, применяющиеся при изучении классических противоопухолевых препаратов. К этому следует добавить, что механизмы действия этих препаратов оставались длительное времени неясными, так как имевшимися в то время методами их было невозможно установить. Как следствие всего этого не проводилось достаточно масштабных клинических испытаний, которые с достаточной степенью уверенности могли бы подтвердить или отвергнуть целесообразность практического применения этих препаратов для лечения онкологических больных.
Ситуация стала меняться в последние 10-15 лет. Применение новых методов молекулярно-биологических исследований позволило выявить некоторые особенности действия ряда препаратов лекарственной альтернативной терапии рака, которые, как оказалось, во многом сходны с действием современных таргетных препаратов. Удалось установить состав этих комплексных препаратов, выделить наиболее активные составляющие, обладающие наибольшим эффектом с точки зрения лечения рака. И, наконец, развитие генной инженерии и медицинской химии сделало возможным получение «чистых» соединений, что позволяет получать стандартизованные препараты в количествах, достаточных для всестороннего экспериментального и клинического изучения.
Среди таких средств лекарственной альтернативной терапии рака следует отметить препараты, получаемые из растения омела белая (Омела Европейская) (Viscum album L.) в виде экстрактов, их отдельных компонентов (лектин, агглютинин), а в последнее время в виде рекомбинантного препарата. Экстракты омелы давно (более полувека) используются в альтернативной терапии, особенно в таких странах Западной Европы, как Швейцария, Германия, Франция, Австрия. Приводятся данные, согласно которым в странах Европы и в настоящее время до ≈40% больных злокачественными опухолями на том или ином этапе заболевания обращаются к препаратам омелы белой [130]. В Германии, например, по данным 2001 года ежегодно тратилось на приобретение этих препаратов до 30 миллионов евро с тенденцией к увеличению этих расходов [126].
Противоопухолевые эффекты экстрактов омелы длительное время связывали исключительно с их иммуномодулирующим действием. В результате исследований последнего десятилетия выяснилось, что препараты омелы, подобно современным конвенциальным таргетным препаратам, способны прямо влиять на внутриклеточные мишени и процессы, вовлеченные в опухолевый рост. Открытие такого механизма противоопухолевого действия препаратов омелы белой стимулировало расширение экспериментальных и клинических исследований их противоопухолевых свойств.
Целью настоящего обзора является анализ накопленных научных данных о разных препаратах омелы белой, которые потенциально могут стать основой для создания нового эффективного противоопухолевого препарата.
Омела белая относится к роду полупаразитарных растений, представляет собой небольшой кустарник или траву, растущую на ветвях деревьев. Омела паразитирует на лиственных (дуб, яблоня, груша, тополь, клен) и хвойных (пихта, сосна, лиственница) деревьях. Для приготовления лекарственных средств используются экстракты, получаемые из молодых веток и листьев. Интересно отметить, что у древних кельтов омела считалась священным растением.
В 1981 году H. Franza сообщил о выделении из экстракта омелы лектина ML-I, который с тех пор стал рассматриваться как основное действующее вещество экстрактов омелы белой [45].
Напомним, что лектины – это широко распространенные в природе белки, обладающие свойством специфично и обратимо связывать как растворенные углеводы, так и функциональные группы углеводов в составе гликопротеинов и гликолипидов. С точки зрения предмета настоящей статьи особенное значение имеет способность лектинов связываться с углеводными компонентами клеточных мембран, в том числе опухолевых клеток.
Лектины омелы белой относятся к семейству растительных белков, инактиваторов рибосом II типа, которые по действию на млекопитающих подразделяются на токсические и нетоксические. Лектины омелы белой (Viscum lectin) относятся к подгруппе токсических инактиваторов рибосом наряду с рицином, абриеном, волкезином. К растительным белкам ингибиторам рибосом относят также рипроксимин, выделенный из растения Ximenia Americana, растущего в Танзании и используемого для лечения рака в традиционной африканской медицине [135].
Близкий по биологической активности, но отличающийся по структуре лектин (агглютинин, VCA) выделен из омелы окрашенной (омелы Корейской) (плоды имеют коричневый цвет) [78] и из омелы гималайской [98].
Все эти вещества считаются потенциальными ингибиторами синтеза белка в эукариотических клетках на уровне рибосом [100].
Белки инактиваторы рибосом состоят из двух полипептидных цепей (А и В), соединенных дисульфидным мостиком [46] (рис.1). Цепь А представляет собой РНК-гликозидазу, способную специфически гидролизовать аденин в большой субъединице рибосомы. В-цепь является гликопротеином, имеющим аффинность к определенным молекулам сахаров, в основном к галактозе. Механизмы токсических эффектов растительных белков инактиваторов рибосом II типа включают поступление белка в клетку, обусловленное связыванием В-цепи с молекулами сахара на клеточной поверхности с последующей интернализацией цепи А, которая катализирует инактивацию рибосом в результате депуринации одного аденозина в 28S рРНК субъединицы 60S рибосомы. Конечным результатом этих процессов является прекращение трансляции и синтеза белка [41, 74, 135].
Рис. 1. Структура молекулы лектина ML-1. Белым цветом обозначена цепь А, зеленым – цепь В,
красным – участки В-цепи, связывающиеся в сахарами [59].
Представляется уместным напомнить здесь, что рибосомы – это важнейшие немембранные органоиды живой эукариотической клетки, представляющие собой рибонуклеопротеидные комплексы, построенные из 2 субъединиц: большой с константой седиминтации (скорость оседания в ультрацентрифуге) 60S и малой с константой седиминтации 40S. Рибосомы служат для биосинтеза белка из аминокислот по заданной матрице на основе генетической информации, предоставляемой мРНК (трансляция). Функция рибосом заключается в узнавании трехбуквенных (трехнуклеотидных) кодонов мРНК, сопоставлении им соответствующих антикодонов транспортных тРНК, несущих аминокислоты, и присоединении этих аминокислот к растущей белковой цепи. Двигаясь вдоль мРНК, рибосома синтезирует белок в соответствии с информацией, заложенной в молекуле мРНК.
Имеются определенные структурные различия в цепях А и В лектинов, выделенных из Европейской, Корейской и Гималайской омелы. Они проявляются различиями в молекулярной массе этих цепей – в лектине Европейской омелы цепь А имеет молекулярную массу 55 kDa, цепь В – 63 kDa, тогда как в лектине из Корейской омелы молекулярные массы этих цепей составляют соответственно 31 kDA и 34 kDa. Выявлены и определенные различия в аминокислотных последовательностях этих лектинов [78, 98].
Основная часть лектинов, определяемых в экстрактах омелы белой, представлена лектином I (ML-I) (часто называемым вискумин –Viscumin) [100]. Другие лектины (лектин ML-II и ML-III) представлены в существенно меньших количествах. Считается, что антипролиферативный эффект экстракта определяется лектином ML-1, хотя имеются данные, что и остальные лектины играют роль в проявлении этого эффекта. Так, в культуре клеток MOLT 4 показано, что лектин III в 10 раз сильнее ингибирует рост этих клеток по сравнению с ML-1 [109]. Лектины омелы белой различаются по специфичности связывания с сахарами на мембране клеток. ML-1 связывается с D-галактозой, тогда как ML-II и ML-III связываются преимущественно с N-ацетил-D-галактозамином [45].
Для проявления цитотоксического действия лектинов омелы (индукции апоптоза), т.е. для противоопухолевого эффекта, необходима как энзематическая цепь А, так и способность цепи В связываться с углеводами [60, 100, 108]. Способность лектинов индуцировать апоптоз дала основание для выдвижения гипотезы, согласно которой эндогенные лектины являются филогенетически ранним механизмом для элиминации из организма клеток с измененной структурой углеводов в клеточной мембране [59].
Значение лектина ML-I в биологической активности препаратов омелы установлена в опытах in vivo с очищенным ML-I. Показано, что в результате введения очищенного лектина кроликам в крови животных достоверно увеличивается цитотоксичность натуральных киллеров, возрастает количество больших гранулярных лимфоцитов, усиливается фагоцитарная активность гранулоцитов. Аналогичные изменения наблюдались у больных раком молочной железы, получавших лечение экстрактом омелы белой [57]. Эти результаты расцениваются как экспериментальное подтверждение связи иммуномодулирующего действия экстракта с наличием в нем лектина ML-I. На основании подобных экспериментов стандартизацию экстрактов омелы белой стали проводить по определению в них активности галактозид-связывающего лектина ML-I.
Помимо лектинов экстракты омелы белой содержат вискотоксины, пептиды Куттата, полисахариды, алкалоиды, висцин и везикл, но их роль в биологических эффектах экстрактов омелы белой пока неясны [60]. Препараты омелы белой готовят либо в виде водных экстрактов (в некоторых случаях с добавлением ферментации), либо путем отжима [74]. С начала 2000-х годов для практического применения и исследования используют экстракты, стандартизованные по содержанию лектинов.
В Европе в течение почти семи десятилетий у онкологических больных и практикующих врачей популярен патентованный препарат Искадор, представляющий собой ферментированный, приготовленный по специальной технологии водный экстракт из листьев омелы белой [146].
Модификациями Искадора являются препараты Искадор QU, который приготовляется путем ферментации водного экстракта омелы, растущей на дубе, Искадор M, сырьем для которого служит омела белая, растущая на яблонях, Искадор Р, приготовляемый из омелы, растущей на сосне, Искадор А является экстрактом омелы белой, паразитирующей на пихте [61, 62].
Другим патентованным препаратом из омелы белой, применяемым в клинической практике, является Искуцин, представляющий собой водный экстракт из цельного высушенного растения, паразитирующего на разных деревьях. Экстрактом из цельного растения является также препарат Isorel.
Следует отметить, что имеющиеся на фармацевтическом рынке препараты омелы белой разных производителей различаются технологией получения экстрактов. Экстракты Искадор получают путем ферментации растительного материала, экстракты Abnoba получают при водной мацерации свежих растений, экстракты Helixor и Isorel получают путем холодной водной экстракции, экстракты Eurixor и Lectinol представляют собой водные экстракты свежего растения, собранного зимой на тополях и осине [102].
Отмечается, что препараты Искадора, полученные из разного сырья, могут различаться по иммуномодулирующей и противоопухолевой активности. Сравнительные исследования цитотоксичности разных экстрактов на клетках рака мочевого пузыря и рака молочной железы обнаружили значительные различия в их активности в зависимости от дерева-хозяина [35, 67]. Считается, что это связано с разным содержанием лектинов в разных экстрактах. Показано, что в Искадоре QU содержание тотальных лектинов составляет 54 нг/мл экстракта, в Искадоре М концентрация лектинов 25 нг/мл экстракта, а в Искадоре Р и Искадоре А содержание лектинов было существенно меньше (1,3 нг/мл и 1 нг/мл экстракта) [33]. Однако, как показали сравнительные исследования противоопухолевой активности этих экстрактов на 4 линиях клеток рака молочной железы и 4 линиях клеток рака мочевого пузыря, полной корреляции между содержанием лектинов в экстракте и его активностью нет. Наибольшей активностью обладал Искадор QU с самым высоким содержанием лектинов, однако Искадор А с наименьшим содержанием лектинов также обладал существенной активностью. Предполагается, что в этом препарате омелы белой помимо лектинов содержатся еще какие-то вещества, обладающие цитотоксическим действием [35].
Экстрактам омелы белой присущи все недостатки, характерные для препаратов природного происхождения, обусловленные в первую очередь сложностью их стандартизации. Биологические свойства разных препаратов зависят от особенностей роста на разных деревьях, на которых паразитирует омела, и региона ее произрастания, времени и условий получения исходного сырья, технологии его переработки, технологии получения лекарственных форм [60].
В 1999 году была разработана рекомбинантная технология получения биохимически чистого лектина ML-I, названного авискумин (rViscumin). Рекомбинантный ML-I был получен путем клонирования и раздельной экспрессии одиночных цепей А и В в Е.coli с последующим получением активного rML-I димера. Доказано, что рекомбинантный rML-1 обладает теми же биологическими свойствами, что и природный ML-I, содержащийся в экстрактах омелы белой, что позволило начать разносторонние экспериментальные исследования Авискумина, а в 2002 году приступить к клиническим испытаниям. [33, 60, 100, 117].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СВОЙСТВ
Экспериментальное исследование противоопухолевой активности препаратов омелы проводили при использовании их в дозах, различающихся на порядки, исходя из представлений, что в наномолярных концентрациях препарат оказывает иммуномодулирующее действие, которое может приводить к опосредованному противоопухолевому эффекту, а в существенно более высоких дозах обладает цитотоксическим действием. Возможно, с этим частично связан значительный разброс в результатах, полученных в разных исследованиях.
Противоопухолевые свойства лектинов омелы исследованы в опытах in vitro и in vivo, причем в последнем случае использовались разные пути введения препаратов, как системные (подкожно, внутривенно, перорально), так и местные (интратуморально, интраперетонеально). G. Kienle c cоавт. к 2009 году нашли 1632 публикации в различных научных журналах, посвященных различным аспектам исследования препаратов омелы белой в экспериментах in vitro и in vivo [74].
Исследования in vitro проводились с использованием разнообразных клеточных линий опухолей человека (меланома, множественная миелома, рак толстой кишки, опухоли центральной нервной системы, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак матки, мелкоклеточный и немелкоклеточный рак легкого, гепатоцеллюлярный рак, рак мочевого пузыря, злокачественные лимфомы, острые лейкозы). Значительное число исследований in vitro выполнялось на стандартных опухолевых клеточных линиях (меланома В16, рак толстой кишки COLO, рак молочной железы MAXE401LL, эпидермальный рак А253, HELA, MILT-4, MEM-223 и пр.). На всех изученных моделях обнаружено разной степени выраженности дозо-зависимое подавление пролиферации опухолевых клеток, во многих исследованиях сочетающееся с появлением признаков, указывающих на индукцию апоптоза в опухолевых клетках. (71, 81, 82, 129, 132, 148].
В опытах in vitro с 6 линиями клеток меланомы человека обнаружено, что лектины омелы белой способны подавлять пролиферацию меланомных клеток в широком диапазоне концентраций (0,001-100 нг/мл), причем в одной из линий (MV3), ультрачувствительной в лектину ML-I, значительное ингибирование роста клеток наблюдалось при введении в культуру лектина в концентрации 1×10-13 нг/мл. Интересно отметить, что этим феноменом объясняют авторы опубликованные в литературе случаи успешного применения препаратов омелы у отдельных больных меланомой [128].
На 6 разных линиях клеток множественной миеломы человека показано, что экстракт омелы белой ингибирует пролиферацию клеток всех линий и увеличивает число апоптотических клеток [82].
При сравнении цитостатического действия лектина омелы окрашенной на клетки рака толстой кишки человека (линия COLO), клетки эпидермального рака (А253) и нормальные клетки (WI-38) обнаружено, что клетки рака толстой кишки гораздо более чувствительны к лектину, чем клетки эпидермального рака. Эффект на клетках COLO имел дозо-зависимый характер в интервале концентраций 10-100 нг/мл с максимумом гибели клеток при концентрации 100 нг/мл. При инкубации клеток COLO с лектином в 64,7% клеток отмечены признаки апоптоза. Что касается нормальных клеток, то не зарегистрировано каких-либо изменений в их жизнеспособности под влиянием лектина [71].
Цитотоксическая активность экстрактов омелы белой обнаружена на клетках опухолей мозга. На 4 линиях медуллобластомы детей обнаружено, что под влиянием этих препаратов снижается митохондриальная активность и усиливается апоптоз опухолевых клеток. Сравнение 8 типов экстрактов, приготовленных из омелы, растущей на разных деревьях, показало, что все экстракты действуют на клетки всех 4 линий, но выраженность эффекта коррелировала с содержанием в них лектинов [148].
Цитотоксическая активность разных водных экстрактов омелы белой исследована в опытах in vitro с использованием панели из 16 линий клеток разных опухолей человека – опухоли центральной нервной системы, рак желудка, молочной и предстательной железы, почки, матки, немелкоклеточный рак легкого, меланома, гематологические опухоли. Опыты проводили с тремя препаратами – Искадор Qu, Искадор М и Искадор Р. Применение Искадора М сопровождалось подавлением пролиферации клеток на 30-70% в 3 линиях клеток, Искадора Qu – в 7. В то же время Искадор Р не оказывал антипролиферативного действия. Следует заметить, что этот препарат, в отличие от двух других, не содержит лектина ML-I. Наибольшее подавление клеточной пролиферации наблюдали при использовании Искадора Qu и Искадора М на клетках рака молочной железы линии MAXF 401NL – при концентрации препаратов 15 мкг/мл рост клеток тормозился более чем на 70%. Введение в культуры клеток всех изученных препаратов не приводило к стимуляции роста ни на одной линии [81, 94]. F. Knofl-Sidler с соавт. сравнили также влияние Искадора Qu, Искадора М и Abnovaviscum Fraxini-2 на пролиферацию клеток в разных культурах опухолевых клеток (HELA-S#, MOLT-4, MFM-223, COR-L51, KPL-1, VM-CUB1) и обнаружили, что все три препарата обладают цитотоксической активностью, но различия в чувствительности клеток разных опухолей к каждому из этих экстрактов омелы были весьма значительноми [81].
В большинстве случаев изучение разных экстрактов омелы белой показало, что цитотоксическая активность препаратов сильно коррелировала с содержанием в них лектина ML-I, хотя имеются данные, указывающие на возможную роль в этом эффекте и других лектинов омелы белой [19].
Аналогичные результаты были получены в более позднем исследовании, в котором изучалось влияние трех других экстрактов омелы белой (Helixor A, Helixor M, Helixor P) на панели из 38 клеточных линий опухолей человека. Цитотоксическая активность (подавление пролиферации клеток более чем на 70%) обнаружена у всех трех препаратов. Наиболее активным оказался Helixor P – рост клеток на 50% подавлялся при концентрации препарата 68,4 мгкг/мл, тогда как для Helixor M и Helixor А эти цифры составляли 114 мкг/мл и 133 мкг/мл соответственно [69].
На 9 разных клеточных линиях рака человека и двух линиях эндотелиальных клеток обнаружено, что чувствительность клеток разных линий к Искадору Qu значительно варьирует; наиболее значительный эффект наблюдали в культурах клеток мелкоклеточного рака легкого, аденокарциномы легкого и молочной железы и в эндотелиальных клетках. Малочувствительными к действию Искадора оказались клетки колоректального рака. A. Burger с соавт. при изучении антипролиферативной активности стандартизованного по лектину водного экстракта омелы белой на 25 клеточных линиях разных опухолей человека и на 47 ксенографтах разных опухолей обнаружили на всех опухолях четкую зависимость эффекта экстракта от дозы лектина. Чувствительность клеток разных опухолей к препарату была весьма вариабельной. Наиболее значительный эффект был отмечен в отношении клеток рака молочной железы, предстательной железы, почек, мелко- и немелкоклеточного рака легкого, острого лимфобластного лейкоза [15].
На 4 разных клеточных линиях рака мочевого пузыря человека (T24, TCCSUP, J82, UM-UC3) водный экстракт омелы оказывал антипролиферативное действие, блокируя рост опухолевых клеток и индуцируя апоптоз, интенсивность которого в клетках разных линий различалась [132].
Вызываемое лектинами омелы подавление клеточной пролиферации, очевидно, зависит от продолжительности воздействия. Так, в экспериментах с 6 линиями клеток опухолей человека (меланома, лимфосаркома, рак молочной железы, рак толстой кишки), в которых водный экстракт омелы белой, стандартизованный по содержанию лектина ML1, контактировал с клетками в течение разного времени (от 24 часов до 6 суток), обнаружено, что концентрации лектина, приводящая к 50%-ному ингибированию пролиферации (IC50) клеток меланомы линии SK-MEL-28, уменьшилась с 4,1нг/мл при 24-часовой инкубации до 0.16 нг/мл при 72-часовой инкубации и 0,18 нг/мл при воздействии в течение 5 суток. Клетки меланомы и лимфосаркомы были более чувствительны к действию экстракта, чем клетки рака молочной железы и рака толстой кишки [17].
В нескольких исследованиях сравнивалась противоопухолевая активность экстрактов омелы с активностью ряда стандартных препаратов. На культуре клеток множественной миеломы человека обнаружено, что в одинаковых дозах (10 мкг/105 клеток) экстракт достоверно сильнее ингибирует пролиферацию клеток, чем винкристин (p<0,01) [82].
Экстракты омелы белой по цитотоксической активности значительно уступали адриамицину, однако чистый лектин ML-I был более активен, чем адриамицин – 50%-ное подавление пролиферации достигалось при концентрации ML-I равной 0,026 мкг/мл, тогда как для адриамицина эта концентрация составляла 0,069 мкг/мл. При применении же экстрактов омелы для ингибирования пролиферации клеток на 50% требовались концентрации 68,4-133 мкг/мл [69].
Burger c соавт. при исследовании антипролиферативной активности стандартизованного по лектину водного экстракта омелы белой и доксорубицина на 25 клеточных линиях разных опухолей человека обнаружили, что при сравнении молярных концентраций экстракта и доксорубицина, вызывающих подавление пролиферации на 70%, противоопухолевая активность экстракта на 3-4 порядка превосходит эффективность доксорубицина. Оказалось также, что спектр чувствительности клеток разных опухолей к экстракту и доксорубицину совпадает [16].
Однако эксперименты на клеточной культуре лейкозных клеток Jukart показали, что доксорубицин существенно (на порядки) более активен, чем водный экстракт омелы. Доза, приводящая к уменьшению числа клеток в культуре на 50% (LC50), для доксорубицина составила 11,68 нг/мл, а для экстракта – 35,67 мкг/мл. При совместном применении доксорубицина и экстракта синергетический эффект достигался только при токсических дозах обоих препаратов [114].
Исследовалась эффективность сочетания препаратов омелы белой в комбинации с конвенциальными цитостатиками. В опытах in vitro с клетками лейкоза человека линий К562 и К61а показано, что rViscumin усиливает цитотоксический эффект ряда противоопухолевых препаратов (винкристин, идарубицин, цисплатин) [50]. Усиление действия доксорубицина, цисплатина, таксола при сочетании с лектином омелы белой показана также на клетках рака легкого человека линии А549 [123]. О перспективности использования препаратов омелы белой совместно с конвенциальными противоопухолевыми препаратами свидетельствуют также результаты экспериментов J. Burkhart с соавт., показавших возможность защиты клеток крови от действия цитостатиков. В этих опытах, проведенных на мононеуклеарных клетках периферической крови, полученных от здоровых доноров, и на клетках Т-клеточного лейкоза Jurkat, показано, что экстракт омелы белой сильно стимулирует митохондриальную активность и репликацию мононуклеаров, причем этот эффект одинаково выражен, как при использовании одного экстракта, так и в комбинации с 4-гидрооксициклофосфамидом. В то же время, экстракт не стимулировал пролиферацию лейкемических клеток и не защищал их от действия 4-гидрооксициклофосфамида [18].
Следует отметить, что большинство исследователей подчеркивают отсутствие опухоль-стимулирующего эффекта у разных препаратов омелы [17, 18, 69]. Однако в нескольких исследованиях показано, что малые (иммуномодулирующие) дозы лектина могут стимулировать пролиферацию опухолевых клеток, причем этот эффект проявлялся лишь на определенных типах клеток. Так, H. Gabius с соавт. при исследовании влияния лектина на рост опухолевых клеток в клеточных линиях сарком и меланом обнаружили, что при культивировании клеток в течение 72 часов в присутствии лектина в концентрации 1 нг/мл в 3 из 8 клеточных линий сарком произошло усиление клеточной пролиферации. В клетках меланомы этого эффекта не наблюдали. В первичных культурах 30 разных опухолей человека, подвергнутых действию малых доз лектина, усиление включения в клетки 3Н-тимидина зарегистрировано в 5 случаях [49].
Эксперименты in vivo. Исследования in vivo проводились как на опухолевых моделях перевиваемых опухолей разных штаммов, так и на ксенографтах опухолей человека, трансплантированных иммунодефицитным мышам. Результаты большинства экспериментов указывают на наличие существенной противоопухолевой активности у препаратов омелы. Регистрируемые эффекты включали торможение роста опухолей, их частичную или в ряде случаев полную регрессию, продление жизни животных-опухоленосителей [8, 14, 71, 137, 104, 106, 107, 112, 115, 119, 121, 130, 144].
Эксперименты на перевиваемых опухолях выполнялись на разных опухолевых штаммах (меланома B16, рак молочной железы ВТ 474, острый лимфобластный лейкоз NALV-6, рак толстой кишки COLO, неходжкинские лимфомы NMR, L5178Y-ML25, рак яичников SОT3, саркомы RAW-117D, L1).
Однократное внутрибрюшинное введение одного из препаратов экстракта омелы (Isorel) мышам с перевитой меланомой В16F10 приводило к уменьшению размеров опухоли на фоне многочисленных очагов некроза с сопутствующими воспалительными реакциями вокруг опухолевой ткани [142]. 4-недельное внутрибрюшинное или подкожное введение водного экстракта омелы белой сопровождалось достоверным ингибированием роста первиваемого почечно-клеточного рака (штамм Renca), рака толстой кишки (C38), рака яичка (F9). В то же время на таких стандартных опухолевых штаммах, как меланома В16 и опухоль Льюис, противоопухолевого эффекта в этом исследовании не зарегистрировано [16].
Противоопухолевая активность препаратов омелы белой показана также на ксенографтах меланомы человека на иммунодефицитных мышах, которым вводили внутрибрюшинно очищенный лектин ML-I в дозах 50, 150 и 500 нг/к. После 19 дней введения препарата отмечено уменьшение веса первичной опухоли на 35% (р=0,03) и на 55% числа легочных метастазов (р=0,016), причем эти эффекты регистрировались только при дозе 30 нг/кг. Однако признаки апоптоза обнаружены только в первичной опухоли, причем при всех изученных дозах, тогда как в легочных метастазах индукции апоптоза не отмечено [130].
На иммунодефицитных мышах с перевитым интраперитонеально раком яичников человека показано, что внутрибрюшинное введение рекомбинатного лектина омелы белой в дозе 500 нг/кг ежедневно приводит к достоверному увеличению выживаемости мышей по сравнению с контролем, при этом 13 из 20 мышей в опытной группе были живы без признаков опухолевых клеток в брюшной полости до конца эксперимента (84 дня после трансплантации опухолевых клеток), тогда как в контрольной группе к этому сроку были живы только два животных. Интересно отметить, что использование лектина в дозе 30 нг/кг также приводило к увеличению числа выживших мышей, тогда как при дозе 150 нг/кг зарегистрировано снижение выживаемости [119].
Очищенный лектин омелы белой (ML-1) обладает противоопухолевым действием и при пероральном приеме. На мышах линии NMR с трансплантированной неходжкинской лимфомой обнаружено, что прием с пищей лектина в дозе 10 мг приводит уменьшению массы опухоли, при этом у 4 из 15 животных опухоль перестала определяться. В опухолях зарегистрировано уменьшение на 75% митотического индекса, двукратное увеличение лимфоидной инфильтрации CD3+ клетками, появление морфологических признаков апоптоза, уменьшение плотности капилляров [107]. При приеме лектина, начиная с 3-го дня после перевивки неходжкинской лимфомы, наблюдали замедление роста опухоли [106].
Противоопухолевое действие препаратов омелы может проявляться как при системном, так и при местном ведении, при этом местное введение считают более эффективным. В качестве доказательства приводятся результаты экспериментов, в которых мышам с трансплантированными в оба бедра клетками рака молочной железы вводили Isorel подкожно в одну конечность дистальнее опухоли. Отмечено значительное замедление роста опухоли, а у нескольких животных почти полная регрессия опухоли, растущей на этой конечности. В опухоли, растущей на противоположной конечности, также регистрировался противоопухолевый эффект, но существенно слабее [144].
Препараты омелы белой, в частности, водные экстракты, оказывают противоопухолевое действие и при внутриопухолевом применении.
В опытах с ксенографтами рака толстой кишки человека интратуморальное введение лектина каждые 2 дня в течение 5 недель, начатое через 5 недель после трансплантации мышам опухолевых клеток, привело к полной регрессии опухоли с замещением опухоли рубцовой тканью во всех случаях [71].
Интратуморальное введение экстракта омелы белой при опухоли молочной железы BT474, трансплантированной мышам BALB/c, привело к достоверному (р<0,05) уменьшению веса опухоли по сравнению с контролем. При гистологическом исследовании этих опухолей выявлено снижение митотического индекса и уровня Ki67, появление признаков апоптоза и увеличение числа некротизированных клеток [8]. В экспериментах с ксенографтами рака поджелудочной железы человека также обнаружена высокая противоопухолевая активность локального применения экстракта омелы белой. В этих опытах препарат вводили интратуморально в дозе 8 мг/кг (5,3 мкг/кг лектина) 2 раза в неделю в течение 8 недель. Противоопухолевый эффект отмечен в 6 из 8 опухолей, в том числе в 3 случаях наступила полная регрессия опухоли, в 3 – частичная. В качестве контроля в этом эксперименте использовалось внутривенное введение гемцитабина: полная регрессия в контроле отмечена у одной опухоли, частичная – в 2 [112].
Противоречивые данные получены при исследовании способности лектина омелы предупреждать развитие опухоли.
U. Elsasse-Beile с соавт. сообщили, что внутрипузырное введение крысам рекомбинантного лектина после четырех внутрипузырных введений N-метил-N-нитрозометилмочевины привело к уменьшению частоты атипической гиперплазии и неопластической трансформации слизистой мочевого пузыря с 82% в контроле до 42-52% при разных схемах введения лектина. У животных, получавших лектин, зарегистрировано уменьшение экспрессии мРНК интерлейкина-10; экспрессия мРНК интерферона-гамма и Fas-лиганда не изменились. Авторы заключили, что лектин омелы способен ингибировать канцерогенез, причем это не связано с иммуномодуляцией [38].
К противоположному заключению пришли E. Kunze с соавт., которые вводили крысам очищенный лектин в иммуномодулирующей дозе (1 нг/кг веса животных) подкожно в течение 6-15 месяцев после 4-кратного перорального введения канцерогена (N-бутил-N-(4-гидроксибутил)-нитрозоамин). Статистически достоверных различий в частоте развития рака мочевого пузыря у животных, получавших лектин, по сравнению с контрольной группой не найдено – через 15 месяцев опухоли обнаружены у 25,8% крыс в контрольной группе и у 19,7% среди получавших лектин (р=0,71). Более того, отмечено, что размеры переходно-клеточных карцином через 15 месяцев после начала эксперимента были больше в экспериментальной группе животных по сравнению с контрольной – средний максимальный диаметр опухоли составил 3,31 мм и 1,88 мм соответственно (р=0,02). При иммуногистохимическом исследовании каких-либо значимых проявлений локального иммунного ответа на применение лектина в стенке мочевого пузыря не наблюдали [85]. Аналогичные данные получили эти авторы и при индукции рака мочевого пузыря внутрипузырными инстилляциями N-метил-N-нитрозометилмочевины [85].
Важным с клинической точки зрения следует считать обнаруженную в ряде экспериментов способность препаратов омелы влиять на метастазирование, в основном в легкие.
Обработка свежим экстрактом омелы белой (Isorel) клеток меланомы В16F10 in vitro до трансплантации мышам вело к уменьшению появления легочных метастазов при росте опухолей у животных [143].
В экспериментах с внутривенной трансплантацией мышам Balb/c клеток саркомы линий RAW-117-P и L-1 показано, что подкожное введение экстракта омелы белой и rViscumin в нетоксических дозах трижды в неделю в течение 14 дней, начиная с вторых суток после трансплантации, привело к достоверному уменьшению числа колоний опухолевых клеток в легких и печени (р<0,05) и существенному продлению жизни мышей [9, 115]. О способности препаратов омелы белой тормозить развитие метастазов свидетельствуют также результаты экспериментов, в которых обнаружено трехкратное снижение числа метастазов в легких при внутривенной трансплантации клеток рака молочной железы [144].
Аналогичные результаты получены также в экспериментах на мышах с введением внутривенно клеток меланомы В16. Внутривенное введением стандартизованного по содержанию лектинов препарата омелы белой (Lectinol) в дозах 3; 30 и 150 нг/кг ежедневно в течение трех недель привело к уменьшению числа легочных метастазов на 58-95% по сравнению с контролем. Этот эффект авторы связали с усилением иммунной клеточной реакции, поскольку в промывных водах, полученных из плевральной полости животных, получавших препарат, обнаружили 5-6-кратное увеличение числа CD11b/CD18 иммунокомпетентных макрофагов и достоверное увеличение незрелых CD4+8+ тимоцитов [137].
Антиметастатическая активность показана также для водного экстракта и очищенных лектинов омелы окрашенной. Введение животным экстракта или лектина за 2 дня до инокуляции опухолевых клеток или на следующий день после этого ингибировало рост метастазов в легких клеток меланомы В16-BL6 и рака толстой кишки линии 26-М3, сочетающееся с повышением выживаемости мышей. На перевиваемой лимфоме L5178Y-ML25 показано также подавление метастазирования в печень и селезенку. Длительное введение лектинов после формирования первичной опухоли приводило к торможению роста как первичных опухолей, так и метастазов. Эти эффекты регистрировались на фоне подавления ангиогенеза, что проявилось уменьшением плотности сосудов в опухоли [104, 136, 141].
Как уже отмечалось выше, в ряде исследований показано, что непосредственный противоопухолевй эффект препаратов омелы сочетался с продлением жизни животных.. Например, в опытах in vivo c трансплантированными мышам клетками острого лимфобластного лейкоза (NALM-6) зарегистрировано под влиянием экстракта омелы белой достоверное увеличением выживаемости животных – среднее время жизни увеличилось с 34,6 дня в контроле до 55,4 дня [121].
Ускорения роста опухолей в опытах in vitro, как правило, не наблюдали. Однако A. Timoshenko с соавт. при изучении роли индукции оксида азота при иммунотерапии перевиваемой аденокарциномы молочной железы на мышах линии C3H/HeJ наблюдали при использовании очищенного лектина омелы белой ускорение роста первичной опухоли и появления легочных метастазов. Этот эффект не был связано с образованием NO [131].
Таким образом, результаты исследования противоопухолевых свойств лектинов омелы на стандартных для противоопухолевой химиотерапии моделях in vitro и in vivo демонстрируют несомненное наличие у препаратов омелы противоопухолевой активности, причем важно отметить, что эти эффекты достигались, как правило, при использовании низких доз и концентраций препаратов и во многих случаях были весьма выраженными.
МЕХАНИЗМЫ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ДЕЙСТВИЯ
Механизмы противоопухолевой активности лектинов омелы связывают как с прямым цитотоксическим действием на опухолевые клетки, так и с опосредованным влиянием в результате модулирования иммунных противоопухолевых реакций.
Прямое противоопухолевое действие лектинов, скорее всего, является следствием ингибирования синтеза белка в результате инактивации рибосом, что проявляется индукцией апоптоза в опухолевых клетках, влиянием на клеточный цикл, подавлением неоангиогенеза. На линиях клеток разных опухолей показано, что экстракт омелы белой (Isorel) ингибирует включение 3Н-меченых аминокислот, что расценивается как указание на роль подавления синтеза белка в противоопухолевом действии препарата [144].
Клеточные и молекулярные механизмы цитотоксического действия экстрактов омелы и выделенных из них очищенных лектинов, специфически связывающихся с галактазидом, исследованы на разных модельных системах.
Получено много экспериментальных данных, указывающих на развитие апоптоза опухолевых клеток в результате действия лектина ML-I. Об этом свидетельствует появление в опухолевой клетке после обработки лектином типичных морфологических признаков апоптоза – сморщивание клетки, конденсация хроматина, интернуклеосомное расщепление ДНК, образование гипердиплоидной ДНК.
В культуре клеток лимфобластного лейкоза человека линии NALM-6 показано, что стандартизованные по содержанию лектина ML-I экстракты омелы белой ингибируют пролиферацию лейкемических клеток, причем этот эффект проявляется при очень низких концентрациях лектина. В клетках, подвергнутых действию препарата, фиксировалась фрагментация ДНК, что расценивалось как указание на гибель клеток в результате индукции апоптоза [121]. При микроскопическом (в том числе электронно-микроскопическом) исследовании опухолевых клеток линии MOLT 4, культивируемых с экстрактом омелы белой, наблюдали такие типичные признаки апоптоза, как перфорация мембраны и появление протрузии цитоплазмы [109].
Об индукции апоптоза под влиянием лектинов омелы свидетельствует также активация каскада каспаз, приводящая к гибели клетки [5].
Обработка ML-I лейкемических Т и В клеток активирует каспазы 3, 9, 8/FLICE и ведет к апоптотической гибели клеток, которая может быть полностью предотвращена введением в культуру ингибитора каспаз. Предполагается, что апоптотический эффект ML-I обусловлен его способностью инактивировать рибосомы и тем самым ингибировать синтез белков, в частности, коротко-живущих ингибиторов каспаз, которые в норме регулируют работу каскада каспаз, прямо связываясь с каспазами 3, 7 и 9 и ингибируя их активность. В качестве косвенного подтверждения гипотезы о связи апоптоза с инбированием синтеза белка приводится факт индукции апоптоза циклогексимидом – известным ингибитором синтеза белка. Еще одним результатом подавления синтеза белка, ведущим к апоптотической гибели клеток, может быть подавление синтеза антиапоптотических белков, таких как Bcl-2 и протеин киназы, которые путем фосфорилирования регуляторных белков оказывают антиапоптотическое действие [5].
На клетках миелолейкоза человека линии U937 показано, что апоптоз, индуцированный действием лектина-II омелы окрашенной, также обусловлен активацией каскада каспаз -3,-8,-9. Это подтверждается отсутствием фрагментации ДНК под влиянием лектина при одновременном введении в культуру ингибитора каспазы-3 [76]. Активация каскада этих каспаз под влиянием лектина омелы окрашенной с одновременным снижением экспрессии антиапоптотических белков, в частности, NF-каппа В, зарегистрированы также в клетках рака толстой кишки человека линии COLO. Активация каспаз под влиянием лектина, вероятно, специфична для опухолевых клеток, т.к. обработка нормальных диплоидных клеток человека WI38 не приводила к изменению экспрессии каспаз [71].
Апоптотическую гибель клеток под влиянием ML-I не связывают с активацией рецептора лиганда смерти CD95 (APO1/FAS) и считают ассоциированной с выделением митохондриями цитохрома с после интернализации лектина [5]. Имеются данные, что механизмы индукции апоптоза могут быть различными для разных экстрактов омелы. Показано, что Искадор Qu вызывает апоптоз по митохондриальному механизму, тогда как Искадор M индуцирует апоптоз с участием «рецептора смерти» [62].
В клетках гепатокарциномы лектин омелы окрашенной, очевидно, индуцирует апоптоз по р53-независимому пути. Это вытекает из экспериментов, в которых был обнаружен одинаковый эффект лектина, в частности, в виде снижения в клетках уровня Bcl-2 и повышения содержания Bax, на клеточных линиях гепатокарциномы SK-Hep-1 (p53-зависимые клетки) и Hep 3B (p53-независимые клетки). Одновременно в клетках обеих линий, а также в эпидермальных клетках А252 обнаружено снижение под влиянием лектина активности теломеразы, что связывают с дефосфорилированием Akt в сигнальном пути трансдукции митогенных сигналов. Предполагается, что развитие апоптоза в этих клетках под влиянием лектина происходит по митохондриальному пути [26, 92].
На трансформированных клетках мышей линии Е1А/ras показано, что совместное воздействие на клетки ионизирующей радиации и лектина омелы приводит к аддитивному антипролиферативному эффекту на фоне усиления активности каспазы-3, причем этот эффект был одинаков как для клеток дефицитных по р53, так и клеток «дикого» типа [65].
Следует подчеркнуть, что в опытах in vitro с клеточными линиями опухолей человека обнаружено, что авискумин способен генерировать в клетках апоптоз при очень низких концентрациях (fM-нM), что в ≈5000 раз превосходит эффект доксорубицина и в ≈1500 раз паклитаксела. Необходимо также отметить способность авискумина сохранять способность индуцировать апоптоз на клеточных линиях, резистентных к доксорубицину и виндезину, и усиливать при совместном применении действие винкристина, ифосфамида, идарубицина, цисплатина [50].
Индукцию лектинами апоптоза в опухолевых клетках связывают также с прооксидантными свойствами лектинов. На клетках миелолейкоза человека линии U937 и гепатокарциномы Нер38 показано, что лектин- II (главный компонент омелы окрашенной) вызывает достоверное увеличение внутриклеточного содержания активированных форм кислорода (в частности, пероксида водорода) и приводит к потере потенциала на мембране митохондрий. Результатом является индукция апоптоза вследствие активации стресс-активируемой протеин киназы (SAPK), выброса из митохондрий в цитозоль цитохрома с, активации каспазы 3 и 9 и распада поли(АДФ-рибоза) полимеразы. Все эти эффекты, в том числе и гибель клеток, предупреждаются антиоксидантами, в частности, восстановленным глютатионом, N-ацетилцистеином и др. [77, 78].
Индукцию апоптоза в опухолевых клетках под влиянием лектина омелы окрашенной удалось блокировать также добавлением в культуру клеток Zn2+ – ингибитора Ca2+/Mg2+ зависимых эндонуклеаз. На основании этих результатов высказано предположение, что цитотоксический эффект лектина опосредован, в том числе, и этими эндонуклеазами [140].
Данные о способности лектинов индуцировать апоптоз в нормальных клетках противоречивы. В опытах с лектином-II омелы окрашенной индукции апоптоза в нормальных лимфоцитах не наблюдали, тогда как в отношении опухолевых клеток в этом эксперименте отмечалось цитостатическое действие. Результаты этих экспериментов расценили как указание на определенную специфичность действия лектинов омелы по отношению к опухолевым клеткам [76]. Однако в опытах с инкубацией лимфоцитов человека с разными экстрактами омелы белой отмечено развитие апоптоза в клетках, причем способность индуцировать апоптоз у разных препаратов омелы, полученной с разных деревьев, произведенных разными производителями, весьма вариабельна и зависит от источника получения сырья и технологии изготовления препарата [19]. Эксперименты с культурой клеток нормальных Т и В лимфоцитов показали, что апоптоз-индуцирующий эффект экстракта омелы белой может быть связан со снижением в клетках уровня антиапоптотических белков Bcl-2 и BCL-x. В этих экспериментах показано также, что индуцированный апоптоз является Fas-независимым [29].
Способность лектинов омелы индуцировать апоптоз опухолевых клеток показана и в экспериментах in vivo.
В опытах с трансплантированной мышам меланомой B16-BL6 в клетках опухолей мышей, получавших очищенный лектин омелы окрашенной, зарегистрированы признаки апоптоза (изменения ядра, фрагментация ДНК, накопление клеток в фазе G1) [104].
Индукция апоптоза в клетках меланомы под влиянием лектина омелы белой показана также на ксенографтах меланомы человека на иммунодефицитных мышах, которым вводили очищенный лектин. Следует отметить, что в этих экспериментах проапоптотическое действие лектина обнаружено только в первичной опухоли, тогда как в легочных метастазах индукции апоптоза не наблюдалось, хотя противоопухолевый эффект отмечался как со стороны первичной опухоли, так и метастазов в легких [130].
Как уже отмечалось, первым этапом реализации цитотоксического эффекта лектинов является связывание цепи В молекулы лектина со специфическими сайтами поверхностной мембраны клеток. Гиперэкспрессия ганглиозидов, ответственных за специфическое связывание лектинов с клетками, зарегистрирована в значительном числе опухолей.
Гиперэкпрессия ганглиозида CD75s обнаружена в клетках в 42-66% опухолей желудочно-кишечного тракта человека, удаленных у 38 больных. Наиболее значительная гиперэкспрессия CD75s отмечена в малодифференцированных опухолях [27].
Высокая концентрация лектин-связывающих сайтов обнаружена на мембранах клеток меланомы, как первичной опухоли, так и метастазов, что расценивается как указание на перспективность применения этих препаратов при лечении меланомы [130].
Следует отметить, что наличие в мембранах опухолевых клеток большого количества сайтов, способных связываться с лектинами омелы белой, указывает на агрессивность течения опухолевого процесса. Об этом свидетельствуют, в частности, результаты исследования A. Thies с соавт., которые гистохимически определяли связывание лектинов омелы белой с клетками меланомы в образцах опухолевой ткани, полученной от 100 больных. Обнаружена достоверная положительная корреляция (р=0,044) между интенсивностью связывания и появлением метастазов в течение 10-летнего наблюдения за больными после удаления первичной опухоли [128].
При иммуногистохимическом исследовании ткани опухоли 226 больных раком молочной железы связывание лектина омелы белой с опухолевыми клетками обнаружено в 34% случаев [48]. При аналогичном исследовании, проведенном на аденокарциноме легкого, установлено, что авискумин связывается с опухолевыми клетками в 92,5% случаев [11].
Цитотоксическое действие rViscumin на клетки промиелоцитарного лейкоза человека линии HL-60 и рака мочевого пузыря 5637 объясняют высоким содержанием в поверхностных мембранах этих клеток ганглиозидных рецепторов (3.68×106 и 1.54×106 молекул на клетку соответственно). Клетки СНО-К1, лишенные таких рецепторов, нечувствительны к действию лектина [100].
Прямой противоопухолевый эффект лектина омелы в отношении клеток лимфоидных опухолей также объясняют специфическим связыванием с D галактозидом, что ведет к индукции р53-независимого апоптоза [65].
О роли специфического связывания лектинов с ганглиозидами мембраны опухолевых клеток свидетельствуют результаты экспериментов с клетками рака толстой кишки человека НТ 29. Обнаружено, что к действию лектинов омелы белой одинаково чувствительны исходные клетки и клетки с индуцированной множественной лекарственной устойчивостью. Показано, что этот эффект связан не с подавлением действия р-гликопротеина, с активацией которого связывают развитие множественной лекарственной устойчивости, а с высокой плотностью сайтов связывания лектинов в мембране этих клеток [133]. В то же время имеются данные, согласно которым лектины омелы белой способны модулировать активность р-гликопротеина (р-помпы) и тем самым ингибировать выброс из клетки ксенобиотиков. Это свойство лектинов рассматривается в качестве еще одного механизма действия этих веществ и приводится для обоснования их применения совместно с цитостатиками при лечении злокачественных опухолей [96].
О роли сайтов связывания с лектинами в мембране опухолевых клеток в реализации противоопухолевого эффекта свидетельствуют результаты экспериментов, в которых показано, что цитотоксичность лектинов омелы заметно ингибируется сывороточными гликопротеинами, в частности, гаптоглобином и трансферрином, вследствие их взаимодействия с молекулой сахара в специфическом гликопротеине мембраны. В результате блокируется связывание лектина с ганглиозидами в мембране опухолевых клеток [44].
Противоопухолевые свойства препаратов омелы связывают также с антиангиогенными свойствами лектинов, которые могут быть обусловлены индукцией апоптоза в эндотелиальных клетках. Индукция экстрактами омелы апоптоза в эндотелиальных клетках показана в экспериментах на линиях клеток эндотелия вен человека, причем наиболее значительной оказалась гибель клеток под влиянием Искадора Qu [30]. Предполагается, что антиметастатический эффект препаратов омелы, наблюдаемый в опытах in vitro и in vivo, частично обусловлен ингибированием ангиогенеза [108].
Подавление ангиогенеза под влиянием очищенного лектина омелы окрашенной отмечено в экспериментах in vitro, в которых оценивался рост сосудов в хорионаллантоисной мембране, индуцированный жировой эмульсией [104]. На модели эндотелиальных клеток EA-hy926, растущих в матригеле, показано, что обработка клеток экстрактом омелы белой приводит к значительному подавлению новообразования сосудов [37]. Однако в опытах с ксенографтами меланомы человека обнаружено, что введение очищенного лектина омелы белой не только не снижает плотность сосудов в первичной опухоли, но и достоверно увеличивает ее при применении высокой дозы лектина (500 нг/кг) в течение 19 дней – среднее число сосудов на 0,5 мм2 жизнеспособной опухоли увеличилось с 32,4±1,6 в контроле до 42,0±1,7 (р<0,001). При более низких дозах лектина (30 нг/кг и 150 нг/кг) плотность сосудов в опухоли также увеличилась, но этот рост был менее выраженным (р<0,05). Следует заметить, что противоопухолевый эффект от применения лектина омелы белой в этом эксперименте все же регистрировался, как со стороны первичной опухоли, так и легочных метастазов (см. выше) [130].
Как отмечалось выше, существенную роль в противоопухолевом эффекте лектинов омелы может играть способность этих соединений ингибировать синтез белка.
Известно, что ингибиторы синтеза белка потенцируют клеточный ответ на действие фактора некроза опухоли-α в результате подавления синтеза протеинов, регулирующих выживаемость клеток. Предполагается, что одним из механизмов противоопухолевого действия лектинов омелы, которые как ингибиторы рибосом влияют на биосинтез белков, может быть усиление противоопухолевого действия эндогенного фактора некроза опухоли-α. Эта гипотеза основывается на экспериментальных данных, согласно которым введение лектинов омелы европейской или корейской в культуру клеток рака шейки матки человека HeLa или в культуру клеток рака молочной железы MCF-7 усиливает в этих клетках апоптоз, индуцированный фактором некроза опухоли-α [103]. В качестве подтверждения этой точки зрения могут служить также данные экспериментов, в которых на клетках рака легкого человека линии А549 оценивался эффект комбинированного применения лектинов с некоторыми цитостатиками (доксорубицин, цисплатин, таксол). Для всех комбинаций обнаружено усиление действия цитостатиков, причем эффект был сопоставим с применением в аналогичных комбинациях циклогексимида – известного мощного ингибитора синтеза белка [123].
В последние годы в качестве потенциальных мишеней для действия противоопухолевых препаратов рассматриваются микроРНК (миРНК) – маленькие молекулы РНК длиной 22 нуклеотида, которые функционируют как посттранскрипционные регуляторы генов. Более 2/3 генов, кодирующих белки, являются мишенями для миРНК. Впервые миРНК были обнаружены в 1993 году в C.elegans; считается, что геном человека может содержать гены около 1000 уникальных миРНК, при этом около700 уже идентифицированы. Генерация миРНК происходит в несколько стадий: вначале в ядре образуются первичные миРНК (pri-miRNA), затем происходит экспорт из ядра предшественников миРНК (pre-miRNA), наконец, в цитозоле образуется 22-нуклеотидная миРНК. Механизм физиологического действия миРНК объясняют комплементарным связыванием с мРНК, в результате чего подавляется трансляция мРНК или происходит их деградация с последующим подавлением протеин-кодируемой экспрессии соответствующих генов [25, 88, 124].
Физиологическая роль миРНК заключается в регуляции важнейших биологических процессов (рост, развитие, дифференцировка, пролиферация, апоптоз). Установлено, что некоторые миРНК могут играть роль онкогенов, другие миРНК выполняют функции опухолевых супрессоров. Во многих злокачественных опухолях человека (рак легкого, молочной железы. мозга, печени, толстой кишки, лейкозы) обнаружена гипер- или гипоэкспрессия определенных миРНК. Выдвинута и экспериментально исследуется гипотеза, что миРНК могут представлять важную мишень для противоопухолевых воздействий. Показано, что воздействие на определенные миРНК (в частности, антисмысловыми олигонуклеотидами) может приводить к нормализации сигнальных путей в опухолевых клетках, обратному развитию опухолевого фенотипа в них или апоптозу [91, 113, 136, 145].
Вероятно, миРНК в опухолях могут быть мишенью для противоопухолевого действия лектинов омелы. L. Li с соавт. обнаружили, что выраженный цитотоксический эффект ML-I из омелы корейской в отношении клеток колоректального рака человека линий CLY и НТ-29 ассоциирован со значительным снижением в клетках уровня миРНК, в основном за счет миРНК-135a&b, обусловленным деградацией ее предшественников. Имеются данные, что эта миРНК играет важную роль в инициации опухолевого роста. Отмечается существенная избирательность этого эффекта – для снижения в опухолевых клетках уровня миРНК на 50% требовались дозы ML-I в 2-4 раза меньшие по сравнению с действием на нормальные клетки [89].
В экспериментах на мышах с перевиваемым асцитным раком Эрлиха обнаружено, что противоопухолевой активностью обладают не только водные экстракты омелы белой, но и экстракты, полученные с сохранением в них веществ, растворимых в неполярных растворителях. При применении этих экстрактов противоопухолевый эффект наблюдался как при их введении животным до перевивки опухоли, так и при уже развившихся опухолях. В клетках, подвергнутых действию таких экстрактов, выявлено снижение активности антиоксидантных ферментов, на основании чего высказано предположение о связи противоопухолевого действия экстракта с индукцией в клетках оксидативного стресса [24].
Ниже суммированы возможные механизмы цитостатического действия лектинов омелы, установленные в разных экспериментах.
Таблица 1. Возможные механизмы цитотоксического действия лектинов омелы белой.
| Возможные механизмы | Ссылки |
|---|---|
| Ингибирование синтеза белка в результате инактивации рибосом | [5, 103, 123, 144] |
| Индукция апоптоза | |
| - появление морфологических признаков апоптоза | [104, 109, 121, 130] |
| - активация каскада каспаз (каспазы 3,7,8,9) | [5, 65, 71, 76] |
| - ингибирование антиапоптотических белков (Bcl-2, NF-каппа В, протеин киназы) | [26, 92] |
| - усиление синтеза проапоптотических белков (Bax) | [26, 92] |
| -усиление выброса митохондриями цитохрома с | [5, 62, 26, 92] |
| - увеличение содержания активированных форм кислорода | [77, 78] |
| Связывание со специфическими сайтами (ганглиозиды) клеточной мембраны | [44, 65, 100, 133] |
| Модулирование активности р-гликопротеина (р-помпа) | [96] |
| Антиангиогенное действие (индукция апоптоза эндотелиальных клеток) | [30, 37, 104, 108] |
| Усиление противоопухолевого действия фактора некроза опухоли-α | [108] |
| Снижение в клетке уровня микроРНК | [89] |
| Индукция оксидативного стресса | [24] |
Иммуномодулирование. В течение длительного времени считалось, что механизм противоопухолевого действия экстрактов и лектина омелы связан исключительно с модификацией как врожденных, так и адаптивных иммунных систем. В настоящее время важной особенностью препаратов омелы белой считается наличие в одном препарате как иммуномодулирующих, так и прямых цитотоксических свойств, что отличает их от большинства противоопухолевых препаратов, являющихся иммунодепрессантами.
Основой иммуномодулирующего действия препаратов омелы белой считается селективное связывание лектина с ганглиозидами CD75s в клеточных мембранах. Высокоспецифичные к лектинам рецепторы – CD75s ганглиозиды – обнаружены в мембране большинства эффекторных клеток иммунной системы. Наличие этих рецепторов, очевидно, объясняет способность лектинов омелы белой связываться с нейтрофилами, моноцитами, макрофагами и другими иммунокомпетентными клетками, в том числе продуцирующими различные цитокины (в частности, с дендритными клетками) [60].
Интересные результаты получены при геномном анализе влияния экстрактов омелы белой из разных источников на функционирование разных генов в клетках 3 линий рака молочной железы (Kpl-1, MCF-7, Mfm-223). Обнаружено, что под влиянием изученных препаратов происходит гиперрегуляция генов, участвующих в формировании иммунной защиты, в ответе организма на стресс и в регуляции межклеточного взаимодействия. Следует заметить, что в этих экспериментах выявлены также различия в реакции тех или иных генов в зависимости от линии клеток и типа препарата омелы белой [34].
В результате многочисленных экспериментальных и клинических исследований установлено, что введение разных препаратов, получаемых из омелы белой, может приводить к изменению разнообразных параметров клеточного и гуморального иммунитета (таблица 2), что расценивается как подтверждение способности этих препаратов модулировать клеточный и гуморальный иммунитет [51, 59].
Это заключение сделано на основании регистрации в крови экспериментальных животных и в периферической крови больных, получавших экстракты омелы или изолированные лектины, увеличения числа и повышения активности натуральных киллеров, возрастания количества больших гранулярных лимфоцитов и фагоцитарной активности гранулоцитов. Как правило, эти эффекты имеют дозо-зависимый характер и начинают проявляться при применении нетоксических, очень низких, нанограммовых доз лектинов [13, 57, 60, 116].
Изменение числа и активности иммунокомпетентных клеток под влиянием лектина показано в ряде экспериментов in vitro и in vivo.
Введение стандартизованного по лектину водного экстракта омелы белой и рекомбинантного лектина мышам Balb/c с трансплантированной саркомой линий RAW-117-P и L-1 сопровождалось увеличением в периферической крови Т-лимфоцитов, NK-клеток и активированных моноцитов, что сочеталось со снижением метастазирования в легкие и печень и увеличением длительности жизни животных [9, 115]. При введении крысам внутривенно rViscumin в дозе 0,5-1,0 нг/кг число больших гранулярных лимфоцитов в периферической крови крыс возрастало в 2,1-3 раза; в 2 раза увеличивалась NK-цитотоксичность спленоцитов против клеток VAC-1 [58].
О способности иммунокомпетентных клеток, активированных лектинами омелы, влиять на опухолевый рост свидетельствуют эксперименты, в которых эти клетки, активированные лектином in vivo или in vitro и введенные животным-опухоленосителям, оказывают противоопухолевое действие. Так, макрофаги, выделенные от мышей, получавших экстракт омелы, и введенные интраперитонеально животным с трансплантированной меланомой В16, тормозят развитие опухоли [86].
Спленоциты, выделенные от мышей, получавших Искадор, также оказывают противоопухолевое действие. Введение этих клеток мышам C57Bl/6 с трансплантированной меланомой В16 увеличило среднее время жизни животных до 68 дней против 19,3 дня в контроле [3]. Введение мышам с меланомой В16F10 спленоцитов, активированных Искадором in vitro, привело к 100%-ному торможению образования легочных метастазов к 21-му дню; введение спленоцитов, активированных in vivo (выделены от мышей, получавших Искадор), тормозило образование метастазов в легких на 93,8% [2].
Добавление в культуру клеток меланомы B16F10 экстракта омелы белой вызывает сенсибилизацию опухолевых клеток к цитотоксическому действию лимфоцитов, причем эффект усиливался при добавлении в культуральную жидкость плазмы крови мышей, получавших экстракт омелы [142].
В опытах in vitro с лимфоцитами мышей-опухоленосителей обнаружено что Isorel усиливает реакцию лимфоцитов на митогены (конковалин А, липополисахарид), что расценивается как указание на иммуностимулирующее действие препарата на лимфоциты, иммуносупрессированные под влиянием опухоли [144].
Модулирование клеточного иммунитета происходит под влиянием низких концентраций лектина, тогда как высокие дозы ведут к гибели некоторых иммунокомпетентных клеток. Об этом свидетельствуют, например, эксперименты, в которых показано, что инкубация лимфоцитов периферической крови с ML-I в концентрации более 10 нг/мл приводит к апоптозу клеток, а в дозах более 10мкг/мл – к некрозу. По чувствительности к ML-I разные клетки, участвующие в реализации клеточного иммунитета, располагаются в следующем ряду: NK, CD19+>CD8+, CD++ [59]. В экспериментах с ксенографтами меланомы человека обнаружено, что введение мышам лектина омелы белой в дозе 30 нг/кг достоверно (р<0,0001) увеличивает число дендритных клеток, инфильтрирующих первичную опухоль. В то же время более высокие дозы (150 и 500 нг/кг) достоверно (р<0,01) индуцировали апоптоз в этих клетках [130].
На клетках нейтрофилов человека отмечено, что при индукции в них апоптоза под влиянием ML-I происходит изменение трансмембранного потенциала митохондрий и возрастает внутриклеточное содержание активных форм кислорода [59]. В то же время высказывается предположение, что усиление иммунологической активности макрофагов крови человека может быть опосредовано оксидом азота, который обнаруживается после введения Искадора в культуру этих клеток [99].
Иммуномодулирующий эффект препаратов омелы белой зарегистрирован в ряде клинических исследований.
Показано, что подкожное введение ML-I в дозе 1 нг/кг 2 раза в неделю больным злокачественными опухолями приводит, помимо повышения в периферической крови активности и числа NK-клеток (CD3-/CD16+56+) и больших гранулярных лимфоцитов, также к возрастанию количества Т и Тh- клеток, усилению экспрессии CD25+ и активности HLA-DQ+, повышению концентрации белков острой фазы, комплементарного фактора С3 [59].
W. Dohmen с соавт. изучили влияние лектина омелы на несколько параметров клеточного иммунитета у 12 больных разными опухолями, получавших водный экстракт омелы белой, стандартизованный по содержанию лектина, подкожно в дозе 15 мг лектина дважды в неделю в течение 48 недель. В период лечения, начиная с первых недель, в периферической крови регистрировалось существенное увеличение всех клеток (лимфоциты, моноциты, NK-клетки, разные субпопуляции лимфоцитов CD3+CD8+, CD3+CD4+). Особенно значительным было увеличение числа NK-клеток, коррелирующее с усилением их цитотоксической активности. Через 6 недель после прекращения лечения все параметры уменьшились до исходного уровня, за исключением числа NK-клеток, количество которых по-прежнему превосходило начальное значение [28].
Однако в проспективном нерандомизированном исследовании, в которое включили 66 больных раком молочной железы, получавших адъювантную химиотерапии по схемам СМF или EC, не было обнаружено какого- либо влияния дополнительной терапии Искадором, проведенной у 33 больных, на иммуносупрессию, индуцированную химиотерапией [90].
Введение экстракта омелы белой здоровым волонтерам также не приводило к увеличению числа активированных NK-клеток [66].
M. Enesel с соавт. обследовали 40 больных с опухолями желудочно-кишечного тракта (рак пищевода, желудка, толстой кишки, поджелудочной железы), которые получали Изорел в течение 2 недель до и 2 недель после операции. Контролем служили 30 больных, подобранных по методу «случай-контроль». Параметры иммунологического статуса определяли до операции и применения препарата, в первый послеоперационный день и на 14-й день. Показано, что введение Изорела достоверно снижает иммунодепрессию, вызванную оперативным вмешательством, причем эти эффекты фиксировались уже через сутки после операции. Положительные эффекты применения Изорела заключались в увеличении в периферической крови числа NK-клеток, Т и В-клеток, в частности, Т-хелперов, повышении уровня комплемента, иммуноглобулинов А, G и М. У больных, получавших Изорел, через 2 месяца после операции отмечали более высокий индекс Карновского, отражающий общее состояние пациента, по сравнению с больными контрольной группы [42].
Положительный эффект применения препаратов омелы белой до операции может быть связан также со способностью лектина омелы белой стимулировать фагоцитарную активность гранулоцитов [59]. Вероятно, этим объясняется способность препаратов омелы белой препятствовать снижению функциональной активности гранулоцитов, обусловленному операционным стрессом. Это показано при исследовании гранулоцитов периферической крови 98 больных раком молочной железы, получавших до операции однократную внутривенную инъекцию Искадора М в дозе 1 мг. Применение препарата предупреждало сопряженное с операцией ингибирование в гранулоцитах «оксидативной вспышки», служащей индикатором их функциональной активности [20].
Роль лектинов в эффектах, вызываемых экстрактом омелы белой, подтверждается экспериментами с участием добровольцев, которым вводили экстракт, специфически, с помощью аффинной хроматографии, очищенный от лектинов, но сохранивший остальные компоненты. Введение такого экстракта не сопровождалось отмеченными выше эффектами; более того, в ряде случаев отмечался иммуносупрессивный эффект. Иммунотоксичность экстракта омелы белой, очищенного от лектинов, связывают с наличием в нем повышенной концентрации вискотоксинов и висцина, которые могут повреждать клеточные мембраны, приводя к гибели иммунокомпетентные клетки [59, 60].
Следует отметить, что иммуномодулирующее действие препаратов омелы, по-видимому, не приводит к стимуляции роста опухолей. Во всяком случае, на 26 клеточных линиях опухолей человека не зарегистрировано усиления пролиферации опухолевых клеток под влиянием разных экстрактов омелы белой [69].
К этому следует добавить, что имеются данные, согласно которым вызываемая экстрактом омелы белой активация NK-клеток приводит к усилению гибели опухолевых клеток, но не затрагивает нормальные клетки [127].
Активацию натуральных киллеров связывают с повышением под влиянием лектинов омелы уровня различных цитокинов [38, 78, 109]. Например, в экспериментах с 24-часовой культурой мононуклеарных клеток периферической крови человека показано, что лектин ML-1 и rViscumin индуцируют достоверное увеличение секреции таких цитокинов, как ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ 10, ИЛ-12, ФНО-α, интерферон-γ, гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор [59].
На ряде линий опухолевых клеток обнаружено, что при одновременном применении лектинов омелы с ФНО-α клетки становятся более чувствительными к индукции апоптоза, вызываемого ФНО-α. Одна из гипотез, с помощью которых пытаются объяснить механизмы противоопухолевого действия лектинов омелы in vivo, обосновывается этими наблюдениями и связывает эффект лектинов с потенцированием действия эндогенного ФНО-альфа [108].
Во время I фазы клинического исследования авискумина также регистрировали увеличение выброса в кровоток цитокинов (интерлейкин-1β, интерлейкин-6, интерферон-γ), увеличение уровня иммуноглобулина G. Отмечалось также появление антител к авискумину [117].
В реализации иммуномодулирующего эффекта ML-1 важную роль, вероятно, играет цепь В молекулы лектина. Показано, что d-галактоза, моносахарид с очень высокой аффинностью к ML-1, полностью блокирует выброс ФНО-α под действием ML-I. В противоположность этому, маноза, которая не обладает аффинностью к ML-I, не оказывает никакого влияния на выброс ФНО-α [59].
Существенное значение в иммуномодулирующем эффекте ML-I придается повышению под его влиянием секреции тотального ИЛ-12 и его активной формы р70. Это связывают с участием ИЛ-12 в регуляции баланса между клеточным и гуморальным иммунитетом, нарушение которого отмечают при развитии злокачественных опухолей [59]. О важной роли увеличения выброса интерлейкина-12 в противоопухолевой активности препаратов омелы белой, опосредованной иммунологическими реакциями, свидетельствуют результаты, полученные J. Duong Van Huen c соавт. Обнаружено, что ингибирование роста меланомы В16F1, имплантированной мышам С57Bl6, под влиянием экстракта омелы белой ассоциировано с усилением секреции интерлейкина-12 и пролиферации спленоцитов. В то же время при трансплантации этой опухоли мышам, дефицитным по интерлейкину-12, противоопухолевого эффекта и усиления пролиферации спленоцитов под влиянием экстракта омелы белой не наблюдали [31].
Таблица 2. Иммуномодуляторные эффекты, индуцируемые лектинами омелы белой.
| Изменение иммунологических показателей | Ссылки |
|---|---|
| Увеличение числа и повышение активности NK-клеток (CD16+) | [9, 13,28, 42, 57, 59, 60, 115, 116] |
| Увеличение количества больших гранулярных лимфоцитов и других типов лимфоцитов (общие лимфоциты CD3+, Т-хелперы CD4+, цитотоксические лимфоциты CD8+) | [9, 13,28, 42, 57, 59, 60, 115, 116] |
| Усиление фагоцитарной активности гранулоцитов | [13, 20, 57, 58, 60, 116] |
| Возрастание уровня цитокинов – интерлейкины (ИЛ-1,ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12), фактор некроза опухоли-альфа, интерферон-гамма | [31, 38, 57, 59, 78, 117, 127] |
| Увеличение уровня иммуноглобулинов (A,G,M) | [42, 117] |
КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Впервые об использовании экстракта омелы белой для лечения онкологического больного сообщил I. Wegman в 1918 г. [147], а в 1920 году R. Steiner предложил экстракт, полученный при смешивании омелы зимнего и летнего урожая, как лекарственное средство для лечения больных злокачественными опухолями. В течение последующих десятилетий препараты омелы применялись на эмпирическом уровне, однако с начала 1980-х годов их стали исследовать как экспериментально, так и клинически [102].
Для практического применения и клинических испытаний использовались различные препараты омелы белой. Наиболее часто применялись водные экстракты, которые могли сильно различаться по составу компонентов в препаратах разных производителей. После идентификации основных компонентов, находящихся в экстрактах, и признания, что для проявления терапевтического эффекта экстрактов основное значение имеет лектин ML-1, водные экстракты стали стандартизировать по этому показателю, и именно такие препараты стали использоваться в последнее десятилетие как в клинических исследованиях, так и в терапевтической практике. Помимо экстрактов в клинической практике использовался очищенный лектин ML-I, в последние годы рекомбинантный лектин ML-I (rViscumin,авискумин).
Следует заметить, что использование и клиническое изучение препаратов омелы белой, как правило, проводится в специальных клиниках альтернативной медицины, а не в обычных онкологических центрах.
Практический опыт применения препаратов омелы белой у онкологических больных отражен в большом числе публикаций, посвященных описанию отдельных случаев эффективного применения этих препаратов. Таких публикаций было много в 1970-1980 годы, они продолжают появляться до настоящего времени. Описываемые случаи в некоторых публикациях были весьма впечатляющими, однако вряд ли они могут быть достаточным основанием с точки зрения доказательной медицины для утверждения о противоопухолевой активности препаратов.
В качестве характерного примера можно привести случай, описанный A. Kirsch (Швейцария). У больного 68 лет через 1,5 года после удаления меланомы кожи плеча при УЗИ брюшной полости выявлен узел в печени, расцененный как одиночный метастаз меланомы. Больной получал терапию подкожными инъекциями Искадора по 2 мг 2 раза в неделю, которая продолжалась 5 лет. После 9-месячной терапии Искадором (другого лечения не было) зарегистрирована полная регрессия очага в печени [79].
Как видно, подобное сообщение, хотя и весьма эффектно, вряд ли может рассматриваться как обоснованное указание на противоопухолевую эффективность терапии Искадором, в первую очередь, в связи с отсутствием гистологической верификации метастаза в печени; суждение о метастатическом происхождении этого очага сделано исключительно на основании УЗИ. Такими и им подобными недостатками, к сожалению, страдает большинство опубликованных отдельных случаев «успешного» применения препаратов омелы.
Надо заметить, что к применению препаратов омелы при меланоме проявляется особый интерес, учитывая имеющиеся представления об определенной чувствительности этой опухоли к иммунотерапии. Вероятно, этим объясняется, что в странах Европы до ≈40% больных меланомой на том или ином этапе заболевания обращаются к препаратам омелы белой [130].
Другой характерный пример. Больной 43 лет произведена пилоросохраняющая резекция головки поджелудочной железы по поводу рака головки с метастазами в печень (pT3, pN1, pM1). После операции проведено 9 циклов комбинированной химиотерапии гемзаром и оксалиплатином. Одновременно с химиотерапией больная получала экстракт омелы белой, которые начали вводить сразу после операции и продолжали к моменту публикации сообщения. Через 10 месяцев после окончания химиотерапии прогрессирования опухолевого процесса не отмечено и, поскольку все это время больная продолжала получать экстракт омелы белой, авторы решили, что столь необычно длинная (с их точки зрения) безрецидивная выживаемость больной связана с применением препарата омелы белой [110]. Очевидно, что подобное утверждение вряд ли можно считать обоснованным. В этом сообщении отражен еще один типичный недостаток подобных сообщений – эффект, наблюдаемый при одновременном применении препарата омелы с конвенциальными противоопухолевыми препаратами, приписывается препарату омелы.
M. Kroz с соавт сообщили о результатах применения rViscumin y 80-летней больной распространенным раком молочной железы (Т3N1M1) с метастазами в кости, лимфоузлы, двусторонним плевритом. Препарат вводили интра-перитуморально и подкожно. После 5-месячного применения препарата отметили частичную регрессию опухоли в молочной железе, метастазов в лимфоузлы и снижение более чем в 2 раза уровня маркера Са15-3. На фоне лечения отмечено значительное улучшение качества жизни, прибавка в весе 10 кг. Ремиссия продолжалась 1 год. При прогрессировании был назначен летрозол, прием которого сочетали с продолжением интратуморального введения rViscumin. Это лечение вновь привело к частичной ремиссии, продолжавшейся около трех лет на фоне удовлетворительного качества жизни [83].
W. Legnavi, проанализировав результаты применения препаратов омелы белой у 100 отдельных больных различными опухолями, обнаружил всего несколько случаев, которые можно было рассматривать как указание на достижение в результате лечения регрессии опухоли [87].
Что касается клинических исследований, то поскольку экстракты омелы белой при их практическом применении у онкологических больных позиционировались, как правило, как средства дополнительной терапии, прямая оценка влияния препаратов омелы на опухоль (т.е. возможность достижения объективного эффекта – регрессии опухоли) проведена лишь в единичных работах, при этом исследовались либо чистый лектин (ML-I), либо рекомбинатный лектин (авискумин, rViscumin). Как правило, это были нерандомизированные исследования I-II фазы.
Наиболее часто в этих испытаниях регистрировалась стабилизация процесса. P. Schoffski с соавт. во время 1-й фазы клинического испытания авискумина, включившего 41 больного с различными распространенными опухолями (колоректальный рак, рак почки и молочной железы), вводили авискумин путем 1-часовой инфузии в центральную вену два раза в неделю каждую неделю. Дозы препарата у разных больных колебались от 10 до 6400 нг/кг. Наилучшим эффектом, оцениваемом по системе RECIST, была стабилизация длительностью от 6 до 24 недель, зарегистрированная у 11 пациентов. Следует отметить, что при фармакокинетическом анализе авискумина в этом исследовании обнаружено короткое время полужизни на α-участке кинетической кривой исчезновения препарата из плазмы (13 минут), что по мнению авторов свидетельствовало о необходимости исследовать длительные инфузии амискумина [117].
При проведении 24-часовых инфузий авискумина у 14 больных установлено, что эффективность авискумина в этом исследовании была сходной с предыдущим: стабилизация отмечена у 4 больных, хотя потенциально активная концентрация препарата в крови при 24-часовой инфузии поддерживалась на протяжении всего времени введения препарата, т.е. в течение суток [118].
Обнаружение гиперэкспрессии ганглиозида CD75s в клетках рака поджелудочной железы послужило основанием для начала клинических испытаний авискумина при этой опухоли. Результаты 1-й фазы оказались обнадеживающими, отмечены случаи объективного эффекта, и клинические испытания препарата при этой опухоли продолжены [27]. В мультицентровом ретроспективном контролируемом исследовании показан также положительный эффект от добавления Искадора к гемцитабину при адъювантной терапии больных, оперированных по поводу рака поджелудочной железы. Эффект заключался в уменьшении симптоматики, обусловленной операцией и химиотерапией, и увеличением общей выживаемости [96].
В исследовании авискумина в рамках I фазы клинических испытаний, организованных EORTC, включившем 26 больных различными опухолями, резистентных к химиотерапии, установлено, что подкожное введение препарата хорошо переносится без развития значимых побочных явлений. У 8 больных (колоректальный рак у 5, меланома, мягкотканая саркома, почечно-клеточный рак по одному) зарегистрирована стабилизация продолжительностью 79-250 дней Применение авискумина привело к повышению в крови уровня интерлейкина 1-β и интерферона-γ, наиболее заметному при введении препарата в дозах 4-5,9 нг/кг [10].
Привлекают внимание данные, указывающие на определенную эффективность экстрактов омелы при гепатоцеллюлярном раке. M. Mabed с соавт. в рамках II фазы клинических испытаний применили экстракт омелы белой, растущей на тополе (препарат вискум фраксини-2 с высоким содержанием лектинов), у 23 ранее не леченых больных. В 3 случаях была зарегистрирована полная ремиссия с длительностью ремиссии 8-38 месяцев, в 2 – частичная ремиссия продолжительностью 6-8 месяцев. У 9 больных во время лечения наблюдалось прогрессирование опухолевого процесса [93].
В нескольких исследованиях показано, что местное введение препаратов омелы белой может замедлить накопление жидкости при метастатическом асците. G. Bar-Sela с соавт. вводили Искадор М внутриперитонеально 23 больным различными опухолями с асцитом, которым требовалась регулярная эвакуация асцитической жидкости. Эффект внутрибрюшинного введения Искадора (по 10 мг) оценивался по изменению длительности интервала между парацентезами. Показано, что применение Искадора привело к удлинению этих интервалов почти в 2 раза. Между первой и второй пункциями (до введения препарата) прошло в среднем 7 дней, тогда как между 2-й пункцией, во время которой ввели Искадор, и следующей прошло 12 дней, а между 3-й пункцией, когда также ввели препарат, и последующим парацентозом интервал составил 13 дней. Эти результаты можно рассматривать как обнадеживающие, хотя относиться к ним нужно с определенной дозой скепсиса, т.к. исследование не было ни рандомизированным, ни контролируемым [6].
Гораздо большее число разнообразных клинических исследований посвящено изучению эффективности препаратов омелы в качестве средства дополнительной лекарственной терапии. В качестве показателей эффективности использовали длительность и качество жизни больных, получавших препараты омелы, влияние их на переносимость стандартного конвенциального лечения. Первая публикация, посвященная описанию результатов нерандомизированного исследования, в котором оценили эффективность дополнительной терапии Искадором онкологических больных, датирована 1963 годом [102].
Следует отметить, что в этих клинических исследованиях использовались разные препараты омелы – тотальные водные экстракты, экстракты, стандартизованные по содержанию лектина ML-1, очищенный лектин, rViscumin. На первоначальных этапах клинического изучения препаратов омелы использовались экстракты, в последние годы основное внимание уделяют авискумину.
Определенная часть этих исследований были рандомизированными, значительная часть проспективными, но не рандомизированными. Как правило, они были контролируемыми, при этом в части исследований контрольную группу составляли больные, не получавшие дополнительного лечения, в других (обычно рандомизированных) больные контрольной группы получали плацебо. Ряд исследований носил характер ретроспективных (эпидемиологических). Необходимо подчеркнуть, что проведение «слепых» и «двойных слепых» клинических исследований препаратов омелы белой осложняется тем, что при подкожных инъекциях этих препаратов часто развивается местная воспалительная реакция, что позволяет пациентам и врачам с 100%-ной уверенностью отличать инъекции препарата омелы от инъекций плацебо [111]. Подобрать плацебо с такими же местными реакциями на введение очень трудно, и к тому же плацебо, обладающее какой-либо токсичностью (т.е. биологическим эффектом), уже не может считаться «пустышкой».
Еще одной причиной сложности организации клинических исследований препаратов омелы белой считают нежелание больных участвовать в исследованиях по изучению неконвенциальных препаратов. Так, по данным I. Gerhard с соавт., которые пытались организовать рандомизированное исследование эффективности экстракта омелы белой в дополнение к стандартной терапии рака молочной железы, за 28 месяцев из 1922 оперированных больных, среди которых 511 соответствовали критериям включения/исключения этого протокола, только 29 дали согласие на участие в исследовании [52]. В аналогичном многоцентровом исследовании, в котором участвовали 6 крупных клиник, за 28 месяцев смогли включить в исследование только 16 пациенток [111].
В конце 1990-х – начале 2000-х годов в Германии и Швейцарии проведено несколько крупных мультицентровых сравнительных ретроспективных эпидемиологических (когортных) исследований безопасности и эффективности длительного применения экстракта омелы белой в качестве адъювантной терапии разных опухолей. Хотя эти исследования были не рандомизироваными, тем не менее, они были организованы в соответствии со стандартами GEP (good epidemiological practice), что позволяет рассматривать полученные результаты как имеющие существенное практическое значение. В 2004 году опубликованы результаты исследования при раке молочной железы, в 2005 г. – при меланоме, в 2009 г. – при колоректальном раке.
В 2004 году P. Bock с соавт. опубликовали статью, в которой проанализировали результаты такого исследования при раке молочной железы I-III стадий. В это исследование было включено 1442 больных, которым проводилось стандартное («конвенциальное») адъювантное лечение (химио-, гормоно-, лучевая терапия). 710 больных из этой группы дополнительно длительно получали подкожные инъекции Искадора; медиана продолжительности этого лечения составила 52 месяца. Остальные 732 больные составили контрольную группу, в которой проводилась только стандартная адъювантная терапия. Следует отметить, что исходно по соотношению прогностически значимых факторов группы не были полностью идентичными; по мнению авторов, больные, получавшие Искадор, имели более распространенный процесс и худший профиль прогностических факторов. Медиана наблюдения за больными составила 67 и 61 месяц соответственно.
Первое, на что обращают внимание авторы при анализе результатов, – это значительное уменьшение в группе Искадора числа побочных явлений, связанных со стандартной терапией (16,3% и 54,1% соответственно, р<0,001), при этом некоторые побочные явления в этой группе вообще не отмечались. Вторым важным результатом они считают увеличение выживаемости – относительная смертность в группе Искадора составила 0,46 от контрольной группы (р=0,038). Серьезных побочных явлений от введения Искадора не зарегистрировано, местные реакции на подкожные инъекции наблюдались у 17,3% больных, системные – у 0,8%. Все эти реакции имели I-II степень тяжести [12].
В другое исследование было включено 686 больных меланомой II и III стадий, из которых 329 после удаления опухоли получали Искадор (подкожно, 2-3 раза в неделю в течение в среднем 30 месяцев). Контрольную группу составили 357 больных, которым после операции проводилось только наблюдение. Обе группы были идентичны по соотношению различных прогностических факторов. Медиана наблюдения за больными составила 81 и 57 месяцев соответственно. Анализ отдаленных результатов показал, что применение Искадора привело к достоверному уменьшению метастазирования в легкие и мозг. Относительный риск смерти от меланомы у получавших Искадор составил 0,41 от контрольной группы (р=0,002); абсолютная смертность от меланомы за период наблюдения снизилась с 10,7% в контроле до 8,9% (р=0,07). Положительный эффект от Искадора выразился также в достоверном увеличении времени до прогрессирования и возрастании общей выживаемости. Серьезных побочных явлений от Искадора не отмечено: местные реакции на инъекции зарегистрированы у 12,8% больных, системные реакции, выражающиеся, как правило, в повышении температуры тела – у 3,3% [4].
Клиническое исследование по аналогичному протоколу, в котором приняли участие 26 центров, было выполнено при колоректальном раке. В это исследование было включено 429 больных, оперированных по поводу колоректального рака I-III стадий, получавших после операции длительное лечение Искадором; медиана продолжительности применения препарата составила 52 месяца. Контрольную группу составили 375 больных, у которых Искадор не использовался. В обеих группах помимо операции проводилось и стандартное адъювантное лечение (химиотерапия, облучение). Медиана продолжительности наблюдения за больными составила 58 и 51 месяц соответственно. Проведенный анализ показал, что у больных, получавших Искадор, достоверно реже возникали побочные явления, обусловленные химиотерапией и облучением – 19% против 48% в контроле (р<0,0010). Лечение Искадором достоверно увеличило время до прогрессирования опухолевого процесса – относительный риск прогрессирования в этой группе составил 0,60 от контрольной группы (р=0,013) [47].
В 1996-1998 гг. под эгидой EORTC было проведено проспективное рандомизированное исследование III фазы эффективности адъюватной терапии больных меланомой III стадии. Одной из задач этого исследования было сравнение эффективности применения для этих целей искадора и интерферонов. В течение 1 года после операции больные получали либо интерферон-α2b, либо интерферон-γ, либо Искадор. Всего в исследование было включено 830 больных, медиана длительности наблюдения за ними составила 8,2 года. Анализ полученных результатов привел исследователей к заключению, что все три способа адъювантной терапии неэффективны – не отмечено статистически достоверного увеличения ни длительности безрецидивного периода, ни общей выживаемости по сравнению с контрольной группой больных, не получавших дополнительного лечения. Тем не менее, можно отметить тенденцию к более высоким показателям в группе больных, получавших Искадор. Общая выживаемость больных в этой группе увеличилась на 21%, тогда как у получавших интерферон-α2b она практически не отличалась от контроля (уменьшилась на 4%), а у получавших интерферон-γ уменьшилась на 13% [80].
В мультицентровом рандомизированном исследовании, включившем 689 больных раком молочной железы, изучили эффективность добавления экстракта омелы к стандартной послеоперационной химио-, гормоно-, лучевой терапии. Комплементарное лечение стандартизованным по количеству лектина экстрактом омелы белой получали 219 больных; 470 больных контрольной группы не получали никакого дополнительного лечения. Установлено, что применение экстракта омелы привело к увеличению безрецидивного периода, особенно заметному у больных раком молочной железы IIa и IIb стадий, и достоверному снижению побочных явлений, вызванных специфической терапией [120].
Введение экстракта омелы до операции может уменьшить угнетение иммунных реакций, индуцированное операцией. В качестве подтверждения этого рассматривают данные клинического исследования, в которое включили 105 больных раком молочной железы. Больных до операции рандомизировали на 2 группы, в одной из которых им перед началом операции вводили 1 мг Искадора М. Иммунный статус оценивали путем определения в условиях ex vivo функционального состояния гранулоцитов, полученных до операции, через 1 и 3 дня после нее. Установлено, что у больных, получивших препарат, угнетение функций гранулоцитов после операции было достоверно (р<0,001) меньше, чем у пациенток контрольной группы [21].
Имеются данные об эффективности длительного применения препаратов омелы белой после завершения стандартной лечения. В эпидемиологическом исследовании, в которое включили 167 больных раком молочной железы, получавших Helixor в течение 5 лет, и 514 аналогичных больных, не имевших дополнительного лечения, обнаружено, что среди больных, леченных Helixor, было достоверно (р<0,001) меньше пациенток, предъявлявших какие-либо жалобы, в том числе обусловленные проводимой ранее терапией (слабость, боли, головные боли, мукозиты). Увеличение случаев бессимптомного течения периода наблюдения коррелировало с достоверным улучшением качества жизни [9].
Однако у больных раком головы и шеи использование экстракта омелы белой, стандартизованного по содержанию лектинов, для адъювантной терапии после хирургического и лучевого лечения не привело к изменению длительности безрецидивного периода и 5-летней выживаемости. Следует заметить, что в этом рандомизированном контролируемом клиническом исследовании не отмечено также какого-либо влияния препарата на клеточные иммунные реакции и на качество жизни больных [126].
В 2002 году P. Goebel с соавт. сообщили о результатах рандомизированного клинического исследования, в которое включили 45 больных раком мочевого пузыря стадий рТаG1-2. В опытной группе больные получали в течение 2 недель после трансуретральной резекции по определенной схеме подкожные инъекции лектина омелы белой; в контрольной группе дополнительного лечения не проводилось. Положительного результата от применения препарата омелы белой не отмечено – время появления первого рецидива и число рецидивов в сравниваемых группах было одинаковым. В 2005 году U. Elsasse-Beile с соавт. сообщили о результатах нерандомизированного исследования в рамках I-II фазы клинических испытаний, в котором препарат омелы белой применялся у больных раком мочевого пузыря для адъювантного лечения в виде внутрипузырных инстилляций. В исследование включили 30 больных, которым через 4 недели после трансуретральной резекции в течение 6 недель еженедельно внутрипузырно вводили по 50 мл водного экстракта омелы белой, стандартизованного по лектину с концентраций последнего от 10 до 5000 нг/мл. Рецидивы опухоли в течение 12 месяцев после операции обнаружены у 33% больных с опухолями рТаG2 и рТ1G2 стадий, что, по данным авторов, соответствовало историческому контролю, в который включили больных с такой же распространенностью процесса, получавших адъювантную терапию БЦЖ. Однако, в отличие от группы БЦЖ, ни у одного больного в группе омелы ни местных, ни системных побочных явлений от введения препарата не зарегистрировано [40].
В рандомизированном двойном слепом исследовании влияния стандартизованного экстракта омелы (PS76A2) на качество жизни 352 больных раком молочной железы, получавших препарат (по 15 нг лектина 2 раза в неделю) в течение 4-6 циклового курса химиотерапии по схеме CMF, обнаружено, что применение экстракта достоверно улучшило качество жизни пациенток (оценивалось с помощью разных опросников) по сравнению с больными, получавшими плацебо. Это различие сохранялось в течение 2 месяцев после окончания химиотерапии [122]. Аналогичное заключение сделано после проведения проспективного нерандомизированного неконтролируемого исследования, в котором 270 больных раком молочной железы во время адъювантной химиотерапии получали препарат омелы белой. По данным опроса больных и врачей, качество жизни больных в течение всего курса химиотерапии и в течение 4 недель после него в большинстве случаев оставалось стабильным или улучшилось. По оценке врачей у 91% больных переносимость лечения была «хорошей» или «очень хорошей»; аналогичная оценка эффективности отмечена в 94% случаев. 89% больных считали, что лечение принесло им значительную пользу [36].
Результаты проспективного когортного исследования, проведенного в Германии, в котором сравнивалась выживаемость больных различными опухолями, получавших Искадор (1668 пациентов), с выживаемостью аналогичных больных, не получавших препарат (8475 больных), показали, что использование Искадора привело к достоверному увеличению выживаемости: среднее время жизни (по всей группе больных) увеличилось с 3,05 года до 4,23 года (р<0.001) [53].
Несколько исследований эффективности Искадора было организовано с использованием парной рандомизации, при которой подбирались пары больных, идентичных по основным прогностическим факторам; одному пациенту из каждой пары случайным образом назначался Искадор, другой служил контролем. Следует заметить, что у всех больных, как в опытных, так и в контрольных группах, в анамнезе было стандартное конвенциальное лечение; у части больных к моменту начала лечения Искадором имелось прогрессирование процесса, остальные находились в состоянии ремиссии.
В одном из таких исследований, в которое было включено 17 пар больных раком молочной железы с метастазами в лимфоузлы, показано, что длительное применение Искадора, привело к достоверному увеличению выживаемости больных, получавших препарат по сравнению с контролем [53, 54]. Это заключение было подтверждено в более позднем мета-анализе результатов 2 аналогичных исследований, в котором было показано, что относительное увеличение выживаемости больных раком молочной железы, леченных Искадором, составило более 40% по сравнению с контролем [147].
В аналогичном исследовании, включившем 41 пару больных раком яичников, также отмечено увеличение выживаемости больных, получавших Искадор, причем у больных с отдаленными метастазами этот эффект был более выраженным, чем у больных без отдаленных метастазов, и оказался статистически достоверным [55]. Результаты двух подобных исследований (56 пар) при раке тела матки оказались противоречивыми. В одном исследовании зарегистрировано достоверное увеличение выживаемости больных, получавших Искадор, тогда как в другом исследовании эффекта от лечения Искадором не отмечено [56].
Одновременно эти авторы провели и нерандомизированные проспективные когортные исследования эффективности Искадора при этих же опухолях, также организованные по методу «случай-контроль». В эти исследования было включено существенно больше больных и во всех случаях зарегистрирована более высокая выживаемость больных, получавших Искадор, по сравнению с контрольными группами. Следует отметить, что как в рандомизированных, так и в нерандомизированных исследованиях фиксировалось улучшение качества жизни и психо-соматического состояния больных на фоне длительного применения Искадора [54, 55, 56, 147].
В последние годы все большее распространение получает проведение обобщенных анализов (мета-анализ) результатов ряда исследований, посвященных какой-либо конкретной проблеме, например, какому-нибудь методу лечения рака. Предполагается, что результаты такого анализа дают более точную и объективную оценку полученных результатов, нежели отдельные исследования. Клинические исследования препаратов омелы белой не являются исключением, периодически публиковались и продолжают появляться результаты обобщенного анализа этих исследований.
Значительным ограничением к проведению такого обобщенного анализа является необходимость включать в него исследования схожие (или очень близкие) по дизайну, контингенту больных, методам лечения, критериям оценки результатов. В тех случаях, когда выполнение этих требований не соблюдается, проведение обобщенного анализа результатов нескольких исследований невозможно или, если он все же проводился, могут быть сделаны ошибочные заключения ввиду большой гетерогенности включенных в него исследований по отмеченным выше критериям. В значительной мере эти ограничения применимы к исследованиям препаратов омелы белой.
В 2003 году G. Kienle с соавт. опубликовали данные обобщенного анализа опубликованных результатов контролируемых клинических исследований препаратов омелы белой. Всего ими было идентифицировано 23 исследования, в том числе 16 рандомизированных, 2 квази-рандомизированных и 5 нерандомизированных, в которых лечили больных разными опухолями (рак молочной железы, легкого, желудка, толстой кишки, почек и мочевого пузыря, опухоли головы и шеи, глиомы, гинекологические опухоли). Статистически достоверное увеличение выживаемости зарегистрировано в 8 исследованиях, регрессия опухолей – в 1, улучшение качества жизни – в 3. В остальных исследованиях какого-либо значимого эффекта по этим параметрам не отметили, а в одном исследовании обнаружили тенденцию к снижению выживаемости у больных, получавших препараты омелы. Следует заметить, что авторы подчеркнули методологическое несовершенство этих исследований [72].
В том же 2003 году появилась работа E. Ernst c соавт., которые, отобрав 10 исследований, которые хотя бы в какой-то мере отвечали стандартам проведения клинических исследований новых препаратов и проведя обобщенный анализ результатов этих исследований, не смогли отметить какого-либо положительного эффекта от применения препаратов омелы белой, в том числе влияния на качество жизни больных [43].
В более поздней работе G. Kienle с соавт, опубликованной в 2007 году, статистически значимое увеличение выживаемости было обнаружено в 8 из 17 клинических исследований, в том числе в 5 из 10 рандомизированных исследований. Регрессия разных опухолей отмечалась только в когортных исследованиях (в 5 из 7), а улучшение качества жизни, особенно при применении препаратов омелы в дополнение к стандартной химиотерапии, регистрировалось в большинстве исследований, как рандомизированных, так и нерандомизированных [73].
В 2008 году M. Horneber с соавт., проанализировав большое число различных баз данных, выявили 80 клинических исследований, в которых изучались противоопухолевые свойства препаратов омелы белой. Для более или менее качественного анализа пригодными оказались только 21 рандомизированное исследование, из них в 13 изучалось влияние препаратов на выживаемость, в 7 оценивался непосредственный противоопухолевый эффект, в 16 анализировалось изменение качества жизни больных при лечении этими препаратами и в 12 приводились сведения о побочных явлениях от применения различных препаратов омелы белой. Всего в эти исследования было включено 3484 больных, исследовались 5 разных препаратов омелы от 5 разных производителей. Основное заключение, сделанное в результате проведенного анализа, сводилось к тому, что пока нет убедительных данных о пользе применения препаратов омелы у онкологических больных, хотя в некоторых отдельных исследованиях регистрировался и непосредственный противоопухолевый эффект, и увеличение длительности жизни больных, и улучшение качества жизни. Авторы особенно выделили 2 исследования, организованных на высоком методологическом уровне, в которых убедительно показано, что применение препаратов омелы белой при химиотерапии больных раком молочной железы приводит к улучшению результатов лечения [64].
Проанализировав 41 контролируемое исследование эффективности Искадора, в которых сравнивалось влияние препарата, применяемого в качестве дополнительного лечения, на выживаемость онкологических больных по сравнению с больными, не получавшими дополнительного лечения, T. Ostermann с соавт. пришли к заключению, что, несмотря на все сложности обобщенного анализа значительно различающихся исследований, результаты анализа следует интерпретировать как указание на возможность реального увеличения длительности жизни больных в результате лечения Искадором. В целом по всей группе проанализированных исследований у получавших Искадор относительный риск смерти составил 0,59 по сравнению с больными контрольной группы (р<0,0001). Следует отметить, что этот эффект был обусловлен в основном результатами нерандомизированных исследований. Наилучшие результаты отмечены в проспективных исследованиях, в которых сравнивались пары идентичных больных, получавших и не получавших Искадор (относительный риск смерти для леченных Искадором составил 0,39 от контроля, р=0,0012). Авторы этой работы, отметив, что происходит постепенное накопление данных о положительном влиянии дополнительного лечения препаратами омелы белой на выживаемость, заметили, что, несмотря на часто встречающиеся в литературе утверждения о неэффективности такого лечения, больные его высоко оценивают [102].
В 2009 г. G. Kienle с соавт. проанализировали результаты клинических исследований экстрактов омелы белой у больных раком молочной железы и гинекологическим раком (рак яичников, шейки и тела матки, интраэпителиальная неоплазия шейки матки), проведенных к этому времени в разных странах. Из 46 отобранных для анализа исследований 19 были рандомизированными, 16 – нерандомизированными проспективными контролируемыми и 11 – когортными неконтролируемыми. В рандомизированные исследования было включено 2420 больных, в нерандомизированные – 6399, в когортные – 1130 пациенток. Авторы пришли к заключению, что, несмотря на определенные методологические погрешности и сравнительно небольшие выборки больных в некоторых исследованиях, полученные результаты следует интерпретировать как указание на возможность достижения у больных этими опухолями положительных эффектов при лечении препаратами омелы белой, как разными экстрактами, так и очищенным лектином. Эти эффекты могут выражаться в продлении жизни больных, получении объективных ремиссий и улучшении качества жизни, особенно заметном при дополнении этими препаратами лучевой и химиотерапии [74].
Однако тогда же J. Melzer с соавт., проанализировав результаты 18 клинических исследований, включивших суммарно более 6800 пациентов, пришли к заключению о невозможности дать однозначный ответ на вопрос о наличии специфической противоопухолевой активности у препаратов омелы белой. В то же время подчеркивалось, что практически во всех исследованиях отмечалось улучшение качества жизни больных с разными опухолями, причем эти эффекты были примерно одинаковыми при использовании разных препаратов [97].
Значительное место в клинических исследованиях препаратов омелы занимает изучение возможности с их помощью улучшать переносимость стандартной химиотерапии. При сравнительном исследовании экстракта омелы (препарат HELIXOR A) и известного фитоиммуномодулятора Lentinan, примененных в дополнение к стандартной химиотерапии у 233 больных (рак молочной железы у 68, рак яичников у 71, немелкоклеточный рак легкого у 94), выяснилось, что число побочных явлений от химиотерапии, в том числе серьезных побочных явлений, в группе омелы было почти в 2 раза меньше, чем в контрольной группе больных, получавших Lentinan [105].
В последние годы при исследовании эффективности новых способов лечения рака большое внимание уделяется анализу влияния этих методов на качество жизни больных. Одной из целей многих клинических испытаний препаратов омелы была оценка именно этого показателя эффективности. Как показал анализ 26 рандомизированных контролируемых и 10 нерандомизированных исследований (в ряде исследований экстракты омелы белой применялись в дополнение к лучевой и химиотерапии), специально направленных на оценку качества жизни больных, получавших препараты омелы белой, в большинстве исследований отмечено несомненное положительное влияние этого лечения на качество жизни больных, в том числе и в исследованиях, организованных на достаточно высоком методологическом уровне. Из 26 рандомизированных исследований улучшение качество жизни регистрировалось в 22; положительный эффект отмечался во всех нерандомизированных исследованиях. Улучшение качества жизни фиксировалось по таким характерным для онкологических больных показателям как утомляемость, нарушение аппетита и сна, стрессовое психо-эмоциональное состояние, похудание, снижение работоспособности, депрессия, чувство страха, тошнота, рвота. Отмечено, что влияние экстрактов омелы на болевой синдром и диаррею было менее выраженным [75, 138].
Улучшение качества жизни больных, в том числе за счет предупреждения или уменьшения побочных эффектов, вызываемых проведением стандартной конвенциальной терапии, считают наиболее заметным положительным результатом практического применения препаратов омелы белой. Это заключение считается также наиболее достоверным, т.к. многие результаты были получены в исследованиях, выполненных в последние годы, когда стали использоваться современные, апробированные и хорошо себя зарекомендовавшие методы оценки изменения качества жизни, при которых качество жизни и физическое состояние оценивается самими больными с помощью разнообразных опросников [74, 75].
Одной из причин улучшения качества жизни больных, получавших препараты омелы, может быть усиление продукции β-эндорфина. Эндорфины – это группа полипептидных химических соединений, по структуре сходных с опиатами, вырабатывающихся в нейронах головного мозга. По накопленным к настоящему времени данным эндорфины относят к главному звену противоболевой системы организма, они противодействуют стрессовым эффектам. По мнению некоторых исследователей, эндорфины способны регулировать эмоции, вплоть до того, что их называют «гормонами счастья» или «гормонами радости», хотя научных обоснований этому нет. Показано, что недостаточность эндорфинов имеет место при многих хронических заболеваниях, синдроме «хронической усталости». В 1994 г. B. Heny и J. Beuth опубликовали статью, в которой показали, что экстракт омелы белой способен усиливать продукцию эндорфинов. При обследовании 36 больных раком молочной железы, получавших в дополнение к стандартной химиотерапии подкожные инъекции экстракта омелы, стандартизованного по содержанию лектина ML-I, по 1 нг/кг 2 раза в неделю в течение 12 недель, обнаружено достоверное (р<0,005) увеличение в плазме крови уровня β-эндорфина. Этот эффект коррелировал с улучшением качества жизни обследованных больных [63].
Как видно из приведенных выше сведений, заключения, сделанные на основании обобщенного анализа результатов большого числа клинических исследований препаратов омелы белой (такой анализ считается наиболее значимым в доказательной медицине), крайне противоречивы. Оценки варьируют от полного отрицания какого-либо положительного эффекта от применения этих препаратов до признания определенной противоопухолевой активности, улучшения качества жизни больных и увеличения выживаемости.
Следует подчеркнуть, что практически все авторы, пытавшиеся провести обобщенный анализ, отмечали значительные сложности, встречающиеся при выполнении этой работы. Это обусловлено значительной гетерогенностью разных конкретных исследований по типам опухолей и составу больных, по изученным препаратам и методам их применения, по критериям оценки эффективности лечения. Немалое значение имела немногочисленность групп больных, включенных во многие исследования, а также недостаточно длительное и неполное прослеживание за больными в исследованиях, в которых оценивалось влияние лечения на выживаемость. В то же время практически во всех работах подчеркивалась целесообразность продолжения исследования препаратов на современном уровне, поскольку и экспериментальные данные, и клинический опыт свидетельствуют о возможности получения в результате таких исследований нового эффективного препарата для лечения онкологических больных.
Следует обратить внимание и на отмечаемое почти всеми авторами методологическое несовершенство проведения значительного числа исследований, при этом, по мнению некоторых авторов, в более слабых с методологических позиций исследованиях чаще отмечались положительные эффекты от применения препаратов омелы белой (например, по влиянию на качество жизни), тогда как в методологически строгих исследованиях таких эффектов зарегистрировать не удавалось [43].
Все это вместе взятое не позволило до сих пор провести полноценного мета-анализа с соответствующей статистической обработкой данных, несмотря на, казалось бы, большой объем таких данных, опубликованный в литературе за последние два десятилетия. Очевидно, что окончательная точка в этой многолетней неопределенности относительно полезности и необходимости препаратов омелы (или какого-либо одного препарата этой группы) для клинической онкологии может быть поставлена только после проведения на современном уровне достаточно крупного многоцентрового исследования. Понятно, что проведение такого исследования встретит существенные трудности, в первую очередь, в плане финансирования, поскольку очевидно, что крупные фармацевтические компании, обладающие возможностями для организации такого исследования, не очень заинтересованы в продвижении этих препаратов.
Потребность в таком исследовании необходима, чтобы понять, почему препарат, который очень многими исследователями признается неэффективным и бесполезным, тем не менее на протяжении десятилетий высоко оценивается и часто используется онкологическими больными [102]. Как показал опрос в одной из областей Швейцарии 108 больных раком (у половины опрошенных был рак молочной железы), 39% больных прибегали к альтернативной терапии при лечении своего заболевания, из них почти ¾ употребляли препараты омелы. Опрос показал, что примерно 20% больных надеялись таким образом увеличить шансы на излечение, остальные принимали эти препараты, стремясь улучшить общее состояние, как физическое, так и психоэмоциональное [134].
ТОКСИЧНОСТЬ
Многолетний опыт клинического применения препаратов омелы белой показывает, что они практически полностью лишены серьезной токсичности, а эксперименты на животных позволили установить отсутствие генотоксического действия [95].
Фармакокинетика лектина после однократного подкожного введения экстракта омелы белой изучена на 15 здоровых волонтерах. Природный лектин ML-I, детектируемый с помощью иммунной цепной полимеразной реакции, определялся в крови сразу после инъекции, но кинетика исчезновения из крови была очень вариабельной; максимум концентрации в среднем достигался через 1 час, медиана этого показателя составила 2 часа. В отдельных случаях ML-I определялся в крови спустя 2 недели после инъекции [66].
Для препаратов омелы белой характерен очень высокий терапевтический индекс; дозы, приводящие к иммуномодулирующему и цитотоксическому эффектам, на порядки меньше токсических доз. Например, для ML-I доза LD50 для мышей составляет несколько сотен мкг/кг, тогда как эффективные дозы не превышают 100-150 нг/кг и чаще всего составляют 1-10 нг/кг. Следует заметить, что иммуномодулирующий эффект, индуцированный оптимальной дозой ML-1 равной 1 нг/кг, держится в течение трех суток [59].
Хотя препараты омелы белой считаются малотоксичными лекарствами, однако при их применении могут все же появляться различные побочные явления. Системные побочные явления от использования экстрактов омелы белой очень редки, обычно не превышают 1-2 степени по шкале ВОЗ и обычно в течение 1 недели самостоятельно купируются. Считается, что нет реального риска от применения экстрактов омелы белой [147].
Однократная подкожная инъекция экстракта омелы белой (препарат AbnovaViscum Fraxini) в дозе 20 мг здоровым волонтерам сопровождалась появлением гриппо-подобного синдрома, повышением температуры тела, сочетавшихся с локальной кожной реакцией в месте инъекции. Все эти реакции были легкой или умеренной степени, но могли продолжаться достаточно долго (от 4 до 95 дней) [66].
Подкожное введение препаратов омелы у большинства больных вызывает появление умеренной местной кожной реакции, которая, как правило, бывает кратковременной и самостоятельно купируется. Развитие подобной реакции ассоциировано с улучшением функции Т-клеток периферической крови [22].
У отдельных пациентов в ответ на введение экстракта омелы белой могут развиваться аллергические реакции вплоть до анафилактического шока. В ряде случаев при этом определялось появление антител к лектинам омелы [7, 68].
После внутривенного введения авискумина могут возникать тошнота, рвота, подниматься температур тела, развиваться аллергическая реакция, чувство усталости.
Дозо-лимитрирующими побочными явлениями, выявленными во время 1-й фазы клинических испытаний авискумина при введении препарата путем 1-часовой инфузии в центральную вену два раза в неделю каждую неделю, были тошнота, утомляемость, повышение щелочной фосфатазы, трансаминаз и гамма-ГТ. Обычно эти токсические проявления дозо-зависимы, встречаются у небольшого числа больных, очень редко достигают 3 степени. Для дальнейших клинических исследований акторы рекомендовали дозу 5600 нг/кг 2 раза в неделю [117]. При 24-часовых инфузиях авискумина дозо-лимитирующая токсичность развивалась при дозе 6 мкг/кг, т.е. при ненамного более высокой дозе по сравнению с 1-часовой инфузией. Проявления дозо-лимитирующей токсичности при обоих способах введения препарата были сходными, как исключение развития гипокалиемии при более длительной инфузии [118].
Необходимо подчеркнуть, что все препараты омелы белой оказывали эффект в дозах (по содержанию лектинов) на три и более порядков меньше эффективных доз известных противоопухолевых препаратов. Это свойство лектинов проявлялось как в опытах in vitro и in vivo, так и при клинических испытаниях и практическом применении препаратов омелы. В молярном выражении эти дозы равняются 10-12–10-13 М, на основании чего можно полагать, что действующие дозы (концентрации) лектинов омелы близки к «сверхмалым дозам» [1].
Ряд исследователей предлагает рассматривать лечение препаратами омелы белой как рациональную фитотерапию, тем самым подчеркивая отличие этого лечения от гомеопатических и антропософных средств [125].
Завершая рассмотрение результатов клинического изучения противоопухолевых свойств препаратов омелы белой, приходится констатировать, что эти исследования не выдерживают никакого сравнения с теми огромными (в первую очередь по финансированию) исследованиями, которые проводят крупные фармацевтические компании при изучении своих препаратов. Это особенно заметно, когда речь идет о сравнительных исследованиях новых противоопухолевых препаратов III фазы, которые носят характер многоцентровых, охватывают сотни и тысячи больных в разных странах, проводятся по единым, строго соблюдаемым четким протоколам с постоянным мониторированием хода исследования и независимым анализом результатов. Ничего подобного не происходит с препаратами альтернативной терапии, в том числе с препаратами омелы белой. Это естественно, т.к. такие масштабные исследования могут спонсировать только очень крупные компании. Понятно, что, начиная такие исследования, они рассчитывают получить в будущем значительную прибыль за счет создания уникального препарата, патентом на который они обладают. С препаратами омелы белой на это рассчитывать не приходится, т.к. ни о какой патентной защите здесь речь идти не может, и, следовательно, изучение препаратов омелы белой в соответствии с принципами доказательной медицины и GCP как бизнес-проект неперспективно. Вряд ли ситуация может измениться, и, следовательно, надеяться на регистрацию этих препаратов в качестве конвенциальных средств не приходится, областью их применения по-прежнему останется альтернативная терапия.
В лекарственном лечении рака имеется очень важная и трудная для разрешения проблема. Мы хорошо знаем, что огромному числу больных злокачественными опухолями, которым проводится химиотерапия, она не поможет ни в плане полного излечения, ни даже в плане получения более или менее длительной ремиссии. В то же время это лечение, особенно новейшими современными препаратами, очень дорого. Естественно, когда у нас есть уверенность, что с достаточно большой долей вероятности с помощью таких препаратов можно излечить больного или хотя бы реально помочь ему, использование их оправдано со всех точек зрения. Но насколько оправдано, в первую очередь с экономических позиций, применение таких препаратов в случаях, когда мы заведомо знаем, что реального эффекта не будет? Но с другой стороны, нельзя оставить больного без лечения, т.е. без надежды. И в таких ситуациях представляется оправданным применение средств альтернативной терапии, естественно, при условии, что такое лечение не будет столь же обременительным как для общественного здравоохранения, так и для конкретного больного и его семьи. Конечно, при этом надо четко отделить препараты альтернативной терапии, для которых есть научные и экспериментальные данные о положительном влиянии на опухолевый процесс, а также клинические сведения о возможности получения положительного эффекта у больных, от «шарлатанских» и «знахарских» способов лечения рака, которые в принципе недопустимы в медицинском сообществе.
Литература
- Корман Д.Б., Островская Л.А., Бурлакова Е.Б., Пальмина Н.П. Химиотерапия сверхмалыми дозами противоопухолевых препаратов – новая стратегия лекарственного лечения злокачественных опухолей // Сб. XII Российский онкологический конгресс. – М. – 2008. – С.107-109.
- Antony S., Kuttan R., Kuttan G. Inhibition of lung metastasi by adoptive immunotherapy using Icador // Immunol.Invest. – 1999. – Vol.28. – P.1-8.
- Antony S., Kuttan R., Kuttan G. // Role of nature killer cells in iscador-mediated inhibition of metastases by adoptive immunotherapy // Immunol.Invest. – 2000. – Vol.29 – P.219-231.
- Augustin M., Bock P.R., Hanisch J. et al. Safety and efficacy of the long-term adjuvant treatment of primary intermediate-tohigh-risk malignant melanoma (UICC/ASCO stage II and III) with a standardized fermented European mistletoe (Viscum album L.) extract. Results from a multicenter comparative, epidemiological cohort study in Germany and Switzerland // Arzneimittelforshung. – 2005. – Vol.55. – P.38-49.
- Bantel H., Engels I.H., Volter W. et al. Mistletoe lectin activates caspase-8/FLICE indenpandently of death receptor signaling and enhances anticancer drug-induced apoptosis // Cancer Res. – 1999. – Vol.59. – P.2083-2090.
- Bar-Sela G., Goldberg H., Beck D. et al. Reducing malignant ascites accumulation by repeated intraperitoneal administrations of a Viscum album extract // Anticancer Res. – 2006. – Vol.26. – P.709-713.
- Baner C., Oppel T., Rueff F., Przybilla B. Anaphylaxis to viscotoxins of mistletoe (Viscum album) extracts // Ann. Allergy Immunol. – 2005. – Vol.94. – P.86-89.
- Benth J., Ko H.L., Schneider H. et al. Intratumoral application of standardized mistletoe extracts down regulates tumor weight via decreased cell proliferation, increased apoptosis and necrosis in a murine model // Anticancer Res. – 2006. – Vol.25. – P.4451-4456.
- Benth J., Schneider b., Schierholz J.H. Impact of complementary treatment of breast cancer patients with standardized mistletoe extract during aftercare:. controlled multicenter comparative, epidemiological cohort study // Anticancer Res. – 2008. – Vol.28. – P.523-527.
- Bergmann L., Aamdal S., Marreand S. et al. Phase I trial of rviscamin (INN:aviscumine) given subcutaneously in patients with advanced cancer: a study of the European organisation for Research and Treatment of cancer (EORTC protocol number 13001) // Europ.J.Cancer. – 2009. – Vol.44. – P.1657-1662.
- Bionski K., Schumacher U., Bukholder J. et al. Binding of recombinant mistletoe lectin (aviscumine) to resected human adenocarcinoma of the lung // Anticancer Res. – 2005. – Vol.25. – P.3303-3307.
- Bock P.R., Friedel W.E., Hanisch J. et al. Efficacy and safety of long-term complementary teratment with standardized European mistletoe extract (Viscum album L.) in addition to the conventional adjuvant oncologic therapy in patients with primary non-metastasized mammary carcinoma. Results of a multicenter comparative, epidemiological cohort study in Germany and Switzerland // Arzneimittelforshung. – 2004. – Vol.54. – P.456-466.
- Braedel-Ruoff S. Immunomodulatory effects of viscum album extracts on natural killer cells: review of clinical trials // Forsch. Komplement Med. – 2010. – Vol.17. – P.63-73.
- Braun J.M., Ko H.L., Schierholz J.M., Benth J. Standardized mistletoe extract augments immune response and down-regulates local and metastatic tumor growth in murine models // Anticancer Res. – 2002. – Vol.22. – P.4187-4190.
- Burger A.M., Mengs U., Schuler J.B., Fiebig H.H. Antiproliferative action of an aqueous mistletoe extract in human tumor cells lines and xenografts in virto // Arzneimittelforshung. – 2001. – Vol.51. – P.748-757.
- Burger A.M., Mengs U., Schuler J.B., Fiebig H.H. Anticancer activity of the aqueous mistletoe extract (AME) in syngenic murine tumor models // Anticancer Res. – 2001. – Vol.21. – P.1965-1968.
- Burger A.M., Mengs U., Kelter G et al. No evidence of stimulation of human tumor cell proliferation by a standardized aqueous mistletoe extract in vitro // Anticancer Res. – 2003. – Vol.23. – P.3801-3806.
- Burkhart J., Walche C., Hensser P. et al. in vivo investigation into the potential of mistleroe extract to alleviate adverse effects of cyclophosphamide // Altern.Ther.Heart Med. – 2010. – Vol.16. – P.40-48.
- Bussing A., Schietzel M. Apoptosis-inducing properties of Viscum album L. extracts from different host trees correleate with their content of toxic mistletoe lectins // Anticancer Res. – 1999. – Vol.19. – P.23-28.
- Bussing A., Bischof M., Hartzmann W. et al. Prevention of surgery-induced suppression of granulocyte function by intravenous application of a fermented extract from Viscum album L. in breast cancer patients // Anticancer Res. – 2005. – Vol.25. – P.4763-4767.
- Bussing A. Immune modulation using mistletoe (Viscum album L.) extracts Iscador // Arzneimittelforshung. – 2006. – Vol.56. – P.508-515.
- Bussing A., Troger W., Stumpf C., Schietzel M. Local reactions to treatment with Viscum album L. extracts and their association with T-lymphocyte subset and quality of life // Anticancer Res. – 2008. – Vol.28. – P.1893-1897.
- Cazacu M., Ohin T., Lungocic C. et al. The unfluence of Isorel on the advanced colorectal cancer // Cancer Biother.Radipharm. – 2003. – Vol.18. – P.27-34.
- Celovic T., Spasic S., Popovic M. Cytotoxic effects of the Viscum album L. extract on Ehrlich tumour cells in vivo // Phytother.Res. – 2008. – Vol.22. – P.1097-1103.
- Cho W.C. OncomiRNAs: The discovery and progress of microRNAs in cancer // Mol.Cancer. – 2007. – Vol.6. – P.60-68.
- Choi S.H., Lyn S.Y., Park W.B. Mistlectoe lectin induces apoptosis and telomerase inhibition in human A253 cancer cells through dephosphorylation of AKT // Arch.Pharm.Res. – 2004. – Vol.27. – P.68-76.
- Dister U., Sonady J., Hulsewig M. et al. Tumor-associated CD75s and iso-CD75s-gangleosides are potential target for adjuvant therapy in pancreatic cancer // Molecular Cancer Therapeutics. – 2008. – Vol.7. – P.2464-2475.
- Dohmen W., Breier M., Mengs U. Cellular immunomodulation and safety of standardized aqueous extract PS76A2 in tumor patients treated for 48 weeks // Anticancer Res. – 2004. – Vol.24. – P.1231-1237.
- Duong van Huyen J.P., Sooryanar R., Delignat S. et al. Variable sensitivity of lymphoblastoid cell to apoptosis induced by Viscum album QuFrF, a therapeutic preparation of mistletoe lectin // Chemotherapy – 2001. – Vol.47. – P.366-376.
- Duong van Huyen J.P., Bayry J., Delignat S. et al. Induction of apoptosis of endothelial cells by Viscum album: a role for antitumoral properties of mistletoe letins // Mol.Med. – 2002. – Vol.8. – P.600-606.
- Duong van Huyen J.P., Delignat S., Bayry J. et al. Interleukin-12 is associated with in vivo anti-tumor effect of mistletoe extracts in B16 mouse melanoma // Cancer Lett. – 2006. – Vol.243. – P.32-37.
- Eck J., Langer M., Mockele B. Et al. Cloning of the mistletoe lectin gene and characterization of the recombinants // Europ.J.Biochem. – 1998. – Vol.264. – P.755-784.
- Eck J., Langer M., Mockele D. Characterization of recombinant and plan-deraived mistleroe lectin and their B-chains // Europ.J.Biochem. – 1999. – Vol.265. – P.788-797.
- Eggenschwiler J., Patrignani A., Wagner U. et al. Gene expession profiles of different breast cancer cells compared with their responsiveness to fermented mistletoe (Viscum album L.) extracts Iscador from oak (Quercus), pine (Pinus), white fir (Abies) and apple trees (Malus) in vitro //Arzneimittelforschung. – 2006. – Vol56. – P.483-496.
- Eggenschwiler J., von Baltzar L., Stritt B. et al. Mistletoe lectin is not only cytotoxic component in fermented preparations of Viscum album from white fir (Abies pectinata) // BMC Complement. Altern.Med. – 2007. – Vol.7. – P.14-19.
- Eisenbrann J., Scheer R., Kroz H. et al. Quality of life in breast cancer patients during chemotherapy and concurent therapy with a mistletoe extract // Phytomedicine. – 2001. – Aug 18.
- Elluru S.R., Duong van Huyen J.P., Delignat S. et al. Antiangiogenic properties of Viscum album extracts are associated with endothelial cytotoxicity // Anticancer Res. – 2009. – Vo.29. – P.2945-2950.
- Elsaaaer-Beile U., Voss M., Schuhle R., Wetterauer U. Biological eggects of natural and recombinant mistletoe lectin and an aqueous mistletoe extracts on human monocytes and lymphocytes in vitro // J.Clin.Lab.Anal. – 2000. – Vol.14. – P.255-259.
- Elsaaaer-Beile U., Ruhnau T., Frendenberg N et al. Antitumoral effect of recombinant mistletor lectin on chemically induced urinary bladder carcinogenesis in a rat model // Cancer. – 2001. – Vol.91. – P.998-1004.
- Elsaaaer-Beile U., Leiber C., Wolf P. et al. Adjuvant intravesical treatment of supeficial bladder cancer with a standardized mistletor extract // J.Urol. – 2005. – Vol.174. – P.76-79.
- Endo Y., Tsurugi K., Franza H. The site of action of the A-chain of mistletoe lectin I on eukaryotic ribosomes. The RNA N-glycosidase activity of the protein // FEBS Lett. – 1988. – Vol 231. – P.378-380.
- Enesel M.B., Acalovschi I., Grosn V. et al. Perioperative application of the Viscum album extract Isorel in digestive tract cancer patients // Anticancer Res. – 2005. – Vol.25. – P.4583-4590.
- Ernst E., Schmidt K., Steuer-Vogt M.K. Mistletoe for cancer? A systematic review of randomized clinical trials // Int.J.Cancer. – 2003. – Vol.107. – P.262-267.
- Frantz M., Jung M.L., Riberean-Gayon G., Anton R. Modulation of mistletoe (Viscum album L.) lectins citotoxicity by carbohydrates and serum glycoproteins // Arzneimittelforshung. – 2000. – Vol.50. – P.471-478.
- Franza H., Ziska P., Kindt A. Isolation and properties of three lectins from mestletoe (Viscum album L.) // Biochem.J. – 1981. – Vol.195. – P.481-484.
- Franza H. Mistletoe lectins and their A and B chains // Oncology. – 1986. – Vol.43. – suppl.1. – P.23-34.
- Friendel W.E., Matthes H., Bock P.R., Zanker K.S. Systematic evaluation of the clinical effects of supportive mistletoe treatment with chemo-and/or radiotherapy protocols and long-term mistletoe application in non-metastatic colorectal carcinoma: controlled, observational cohort study // J.Soc.Integr.Oncol. – 2009. – Vol.7. – P.137-145.
- Fritz P., Dippon J., Kierschke T. et al. Impact of mistletoe lectin binding in breast cancer // Anticancer res. – 2004. – Vol.24. – P.1187-1192.
- Gabins H.L., Darro F., Remmelin M. et al. Evidence for stimulation of tumor proliferation on cell lines and histotypic cultures by clinically relevant low doses of the galactoside-binding mestletor lectin, a component of proprietary extracts // Cancer Invest. – 2001. – Vol.19. – P.114-126.
- Galm O., Fabry U., Efferth T., Osieka R. Synergism between rViscumin and cisplatin in not dependent on ERCC-1 exppression // Cancer Let. – 2002. – Vol.187. – P.143-151.
- Gardin N.E. Immunological response to mistletoe (Viscum album L.) in cancer patients: a four case series // Phytother Res. – 2009. – Vol.23. – P.407-411.
- Gerhard I., Abel U., Loewe-Mesch A. et al. Problems of randomized studies in complementary medicine demonstratited in a study of mistletoe treatment of patients with breast cancer // Forsch.Komplementar Med. Klass Naturheilkd. – 2004. – Vol.11. – P.150-157.
- Grossarth-Naticek R., Kienl H., Baumgartner S.M., Ziegler R. Use of Iscador, an extract of European mistletoe (Viscum album) in cancer treatment: prospective nonrandomized and randomized matched-pair studies nested within a cohort study // Altern. Ther. Health Med. – 2001. – Vol.7. – P.57-66.
- Grossarth-Naticek R., Ziegler R. Randomised and non-randomised prospective controlled cohort studies in matched-pair design for long-term therapy of breast cancer patients with mistletoe preparation (Iscador): a re-analysis // Eur.J.Med.Res. – 2006. – Vol.11. – P.485-495.
- Grossarth-Naticek R., Ziegler R. Prospective controlle cohort studies on long-term therapy of ovarian cancer patients with mistletoe (Viscum album L.) extracts Iscador // Arzneimittelforschung – 2007. – Vol.57. – P.665-678.
- Grossarth-Naticek R., Ziegler R.Randomized and non-randomized prospective controlled cohort studies in matched-pair design for long-term therapy of corpus uteri cancer patients with a mistletoe preparation (Iscador) // Eur.J.Med.Res. – 2008. – Vol.13. – P.107-120.
- Hajto T., Hostanska K., Gabins H.L. Modulatory potency of the beta-galactoside-specific lectin from mistletoe extract (Iscador) on the host defense system in vivo in rabbits and patients // Cancer Res. – 1989. – Vol.49. – P.4803-4808.
- Hajto T., Hostanska K., Weber K. et al. Effect of recombinant lectin Viscum album agglutinin on the cultered human peripheral blood mononuclear cells and on NK-cell-mediated cytotoxicity of rat splenocytes in vitro and in vivo // Nat. Immun. – 1998. – Vol.16. – P.34-46.
- Hajto T., Hostanska K., Berki T. et al. Oncopharmacological perspectives of a plant lectin (Viscum album agglutinin-1): overview recent results from in vitro experiments and in vivo animal models and their possible relevance for clinical applications // eCAM. – 2005. – Vol.2. – P.59-67.
- Hajto T., Fodor K., Perjesi P., Nemeth P. Difficulties and perspectives of immunomodulatory therapy with mistletoe lectins and standardized mistletoe extracts in evidence-based medicine // eCAM. – 2009. – published on line 25.11.
- Harmsma M., Gromme M., Ummelen M. et al. Differential effects of Viscum album extract Iscador on cell cycle progression and apoptosis in cancer cells // Int.J.Oncol. – 2004. – Vol.25. – P.1521-1529.
- Harmsma M., Ummelen M., Dignet W. et al. Effects of mistletoe (Viscum albim L.) extracts Iscador on cell cycle and survival of tumor cells // Arzneimittelforschung .– 2006. – Vol.56. – P.474-482.
- Heiny B.M., Beuth J. Mistleroe extract standardized for galactoside-specific lectin (ML-I) induces beta-endorphin release and immunopotentiation in breast cancer patients // Anticancer Res. – 1994. – Vol. – 14. – P.1339-1342.
- Horneberr M.A., Bueschel G., Huber R. et al. Mistletoe therapy in oncology // Cochrane Database Syst.Rev. – 2008. – apr.16 (2): CD 003297.
- Hostanska K., Vuong V., Rocha S. et al. Recombinant mistletoe lectin induces p53-independent apoptosis in tumor cells and cooperates with ionizing radiation // Br.J.Cancer. – 2003 – Vol.88. – P.1785-1792.
- Huber R., Eisenbraun J., Miletzki B. et al. Pharmacokinetics fo natural mistletoe lectins after subcutaneous injection // Eur.J.Clin.Pharmacol. – 2010. – Vol.66. – P.889-897.
- Hunziker-Basler N., Zuzak T.J., Eggen-Schwiler J et al. Prolonged cytotoxic effect of aqueous extracts from dried viscum album on bladder cancer cells // Pharmazie. – 2007. – Vol.62 – P.237-238.
- Hutt N., Kopfeischmitt-Kubler M., Cabalion J. et al. Anaphylactic reactions after therapeutic injection of mistletoe (Viscum album L.) // Allergol.Immunopathol. – 2001. – Vol.29. – P.201-203.
- Kelter G., Fielbig H.H. Absence of tumor growth stimulation in a panel of 26 human tumor cell lines by mistletoe (Viscum album L.) extracrs Iscador in vitro // Arzneimittelforschung. – 2006. – Vol.56. – P.435-440.
- Kelter G., Schierholz J.M., Fischer I.U, Fielbig H.H. Cytotoxic activity and absence of tumor growth stimulation of standardized mistletoe extracts in human tumor models in vitro // Anticancer Res. – 2007. – Vol.27. – P.223-233.
- Khil L.Y., Kim W., Lyu S. et el. Mechanisms involved in Korean mistletoe lectin-induced apoptosis of cancer cells // Word J.Gastroenterol. – 2007. – Vol.13. – P.2811-2818.
- Kienle G.S., Berrino F., Bussing A. et al. Mistletoe in cancer – a systematic review on controlled clinical teials // Eur.J.Med.Res. – 2003. – Vol.8. – P.109-119.
- Kienle G.S., Kiene H. Complementary cancer therapy: a systematic review of prospective clinical trials on anthroposophic mistletoe extracts // Eur.J.Med.Res. – 2007. – Vol.26. – P.103-119.
- Kienle G.S., Glookman A., Schink M., Kiene H. Viscum album L. Extracts in breast and gynecological cancers: a systematic review of clinical and preclinical research // J.Exp.Clin.Cancer Res. – 2009. – Vol.29. – P.79-91.
- Kienle G.S., Kiene H. Review article: influence of Viscum album L. (European mistlerot) extracts on quality of life in cancer patients: a systematic review of controlled clinical studies // Intergr. Cancer Ther. – 2010. – Vol.9. – P.142-157.
- Kim M.S., So H.S., Lee K.M. et al. Activation of caspase cascades in Korean mistletoe (Viscum album var.coloratum) lectin II-induced apoptosis of human myeloleukemic U937 cells // Gen.Pharmacol. – 2000. – Vol.34. – P.349-355.
- Kim M.S., Lee K.M, Yang S.H. et al. Involvement of hydrogen peroxide in mistletoe lectin II-induced apoptosis of human myeloleukemic U937 cells // Life Sci. – 2003. – Vol.73. – P.1231-143.
- Kim W.H., Park W.B., Gao B., Jung M.H. Critical role of reactive species and mitochondrial membrane potential in Korean mistletoe lectin-induced apoptosis in human hepatocarcinoms cells // Mol.Pharmacol. – 2004. – Vol.66. – P.1383-1396.
- Kirsch A. Succesful treatment of metastatic malignant melanoma with Viscum album extraxt (Iscador M) // J.Alter.Complement.Med. – 2007. – Vol.13. – P.443-445.
- Kleber U.R., Sucin S., Brocker E.B. et al. Final results of the EORTC 18871 DKG 80-1 randomised phase II trial, rIFN-alpha26 versus rIFN-gamma versus Iscador M versus observation after surgery in melanoma patients with either high-risk primary (thickness >3 mm) or regional lymph node metastasis // Eur.J.Cancer. – 2004. – Vol.40. – P.390-402.
- Knopfl-Sidler F., Viviani A., Rist L., Hensel A. Human cancer cells exhibit in vivo individual receptiveness towards different mistletoe extracts // Pharmazie. – 2005. – Vol.60. – P.448-454.
- Kovacs E. Investigation of the proliferation, apoptosis/necrosis and cell cycle phases in several human multiple myeloma cell lines. Comparison of viscum album QuFrF extrac twith vincristine in an in vitro model // Scientific Word J. – 2010. – Vol.10. – P.311320.
- Kroz M., Schad F., Matthes B. et al. Blood and tissue eosinophilia, mistletoe lectin antibodies and quality of life in a breast cancer patients undergoing intratumoral and subcutaneius mistletor therapy // Forsch.Komplementar. Med. Klass Naturheikd. – 2002. – Vol.9. – P.160-167.
- Kumze E., Ashulz H., Galins H.J. Inability of galactoside-specific mistleroe lectin to inhibit N-methyl-N-nitrourea-induced tumor development in the urinary bladder of rats and to mediate a local cellular immune response after long-term administration // J.Cancer Res.Clinical Oncol. – 1998. – Vol.124. – P.73-87.
- Kunze E., Schulz H., Adamek M., Cabins H.J. Long-term administration of galactoside-specific mistleroe lectin in an animal model: no protection against N-butyl-N-(N-hidroxybutel)-nitrosoamine-induced urinary bladder carcinogenesis in rats and no induction of a relevant local cellular immune tesponse // J.Cancer Res.Clin.Oncol. – 2000. – Vol. 126. – P.125-138.
- Kuttan G. Tumorocidal activity of mouse peritoneal macrophage treated with Viscum album extract // Immunol.Invest. – 1993. – Vol.22. – P.431-440.
- Legnani W. Mistletoe in conventional oncological practice:exemplary cases // Intergr.Cancer Ther. – 2008. – Vol.7. – P.162-171.
- Li C., Feng Y., Coukos G., Zhang L. Therapeutic microRNA strategies in human cancer // AAPS J. – 2009. – Vol.11. – P.747-757.
- Li L.N., Zhang H.D., Zhi R., Uuan S.J. Down-regulation of some miRNAs by degradaing their precorses contributes to anti-cancer effect of mistletoe lectin-I // Br.J.Pharmacok. – 2011. – Vol.162. – P.349-364.
- Loewe-mensch A., Kuehn J.J., Borto K. et al. Adjuvant simultaneous mistletoe chemotherapy in breast cancer – influence on immunological parameters? Quality of life and tolerability // Forch.Komplement.Med. – 2008. – Vol.15. – P.22-30.
- Lynam-Lennon N., Maher S.S., Reynolds J.V. The roles of microRNA in cancer and apoptosis // Biol.Rev.Camb.Philis.Soc. – 2009. – Vol.84. – P.55-71.
- Lyu S.Y., Choi S.H., Park W.B. Korean mistletoe lectin-induced apoptosis in hepatocarcinoma cells is associated with inhibition of telomerase via mitochondrial controlled pathway independent of p53 // Arch.Pharm.Res. – 2002. – Vol.25. – P.93-101.
- Mabed M., El-Helw L., Shamaa S. Phase II study of viscum fraxini 2 in patients wirh advanced hepatocellular carcinoma // Br.J.Cancer – 2004. – Vol.90. – P.65-69.
- Maier G., Fiebig H.H. Absence of tumor growth stimulation in a panel of 16 human tumor cell lines by mistletoe extracts in vivo // Anticancer Drugs – 2002. – Vol.13. – P.373-379.
- Maldacker J. Preclinical investigations with mistletoe (Viscum album L.) extract Iscador // Arzneimettelforschung – 2006. – Vol.56. – P.497-507.
- Matthes H., Friede W.E., Bock P.R., Zanker K.S. Molecular mistletoe therapy :friend or foe in establisched anti-tumor protocols? A multucenter, controlled, retrospective pharmaco-epidemiological study in pancreas cancer // Curr.Mol.Med. – 2010. – Vol.10. – P.430-439.
- Melzer J., Iten F., Hostanski K., Saller R. Efficacy and safety of mistletoe preparations (Viscum album) for patients with cancer diseases. A systematic review // Forch. Komplement.Med. – 2009. – Vol 16. – P.217-226.
- Mishra V., Ethayathulla A.S., Sarwa R.S. et al. Structure of a novel ribosome-inactivating protein from a hemi-parasitic plant inhabiting the northwestern Hymalayas // Acta Crystallogr.Biol.Grystallorg. – 2004. – Vol.60. – P.2295-2305.
- Mossalayi M.D., Alkharrat A., Malvy D. Nitric oxide involvement in the anti-tumor effect of mistletoe (Viscum album L.) extracts Iscador in human macrophages // Arzneimettelforschung – 2006. – Vol.56. – P.477-460.
- Muthing J., Breg M., Mockel N. et al. Preferential binding of the anticancer drug rViscumin (recombinant mistletoe lectin) to terminaly alpha2-6-sialylated neolacto-series gangliosides // Clyobiology. – 2002. – Vol.12. – P.485-497.
- Mutting J., Maisem I., Khiep b. et al. Tumor-associated CD75s gangliosides and CD75s-bearing glicoproteins with Neu5AC alpha2-6Gabeta1-4Gec NAc – residues are receptor for the anticancer drug rViscumin // FASEB. – 2005. – Vol.19. – P.103-105.
- Ostermann T., Raak C., Bussing A. Survival of cancer patients treated with mistletoe extract (Iscador): a systematic literature review // BMC cancer. – 2009. – Vol.9 – P.541-462.
- Pae H.Q., Seo W.G., Oh G.S. et al. Potentiation of tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis be mistletoe lectin // Immunopharmacol.Immunotoxicol. – 2000. – Vol.22. – P.697-709.
- Park W.B., Lyu S.Y., Kim J.N. et al. Inhibition of tumor growth and metastasis by Korean mistletoe lectin is associated with apoptosis and antiangiogenesis // Cancer Biothet.Radiopharm. – 2001. – Vol.16. – P.439-447.
- Piao B.K., Wang Y.X., Xie G.R. et al. Impact of complementary mistletoe extract treatment on quality of life in breast, Ovarian and non-small ctll lyng cancer patients. A prospective randomized controlled clinical traial // Anticancer Res. – 2004. – Vol.24. – P.303-309.
- Pryme I.F., Bardoc Z., Pusztai A., Ewen S.W. Dietary mistletoe lectin supplementation and reduced growth of a murine non-Hodgkin lymphoma // Histol.Histopathol. – 2002. – Vol.17. – P.261-271.
- Pryme I.F., Bardoc Z., Pusztai A. et al. A mistletoe lectin (ML-I)-containing diet reduced the viability a murine non-Hodgkin lymphoma tumor // Cancer Detect.Prev. – 2004. – Vol.28. – P.52-56.
- Pryme I.F., Bardoc Z., Pusztai A., Ewen S.W. Suppression of growth of tumor cell lines in vitro and tumors in vivo by mistletoe lectins // Histol.Histopathol. – 2006. – Vol.21. – P.285-299.
- Riberean-Gayon G., Jung M.L., Frantz M., Anton R. Modulation of cytotoxicity and enhacement of cytokine release induced by Viscum album L. extracts or mistletoe lectins // Anticancer Drugs. – 1997. – Suppl.1. – P.3-8.
- Ritter P.R., Tischoff I., Uhl W. et al. Sustained partial remission of metastatic pancreatic cancer following sestemic chemotherapy with gemcitabin and oxaliplatin plus adjunctive treatment with mistlwtoe extract // Oncologie. – 2010. – Vol.33. – P.617-619.
- Rostok M., Huber R. Randomized and double-blind studies – demands and realty as demonstrated be two examples of mistletoe research // Forch.Komplementar.Med.Klass Naturheilkd. – 2004. – Vol.11. – suppl.1. – P.18-22.
- Rostok M., Huber R., Greiner T. et al. Anticancer activityt of a lectin-rich mistletoe extract injected intratumorally into human pancreatic cancer xenografts // Anticancer Res. – 2005. – Vol.25. – 1969-1975/
- Rushworth S.A. Targeting the oncogenic role of miRNA in human cancer using naturally occurring compounds // Br.J.Pharmacol. – 2011. – Vol.162. – P.346-348.
- Sabova L., Pilatova M., Szilogyl K. et al. Cytotoxic effect of mistletoe (Viscum album L.) extract on Jurlat cells and its interaction with doxorubicin // Phytother.Res. – 2010. – Vol.24. – P.365-368.
- Schaffrfth B., Mangs U., Schwartz T. et al. Anticancer activity of rViscumin (recombinant mistletoe lectin) in tumor colonization models with immunocompetent mice // Anticancer Res. – 2001. – Vol.21. – P.3981-3987.
- Schink M. Mistletoe therapy for human cancer: the role of the natural killer cells // Anticancer Drugs. – 1997. – Vol8. – Suppl.1. – P.47-55.
- Schoffski P., Riggert S., Fumolean P. et al. Phase I trial of intravenous aviscumine (rViscumin) in patients with solid tumors: a study of the European organization for research and treatment of cancer // Ann.Oncol. – 2004. – Vol.15. – P.1816-1824.
- Schoffski P., Breidenbach I., Kiauter J. et al. Weekly 24h infusion of aviscumine (rViscumin): a phase I study in patients with solid tumours // Europ.J.Cancer. – 2005. – Vol.41. – P.1431-1438.
- Schumacher U., Feldhaus S., Mengs U. Recombinant mistletoe lectin (rML) is successful in threating human ovarian cancer cells transplanted into severe combined immunodeficient (SCID) mice // Cancer Lett. – 2000. – Vol.150. – P.171-175.
- Schumacher K., Schneider B., Reiche G. et al. Influence of postoperative complementary treatment with lectin standardized mistletoe extract on breast cancer patients. A controlled epidemiological multicentric retrospective cohort study // Anticancer Res. – 2003. – Vol.23. – P.5081-5087.
- Siebert G., Jesse P., Laengier A. et al. Molecular mechanisms of mistletoe plant extract-induced apoptosis in acute lymphoblastic leukemia in vivo and in vitro // Cancer Lett. – 2008. – Vol.264. – P.218-228.
- Semiglszov V.F., Stepula V.V., Dudov A. et al. Quality of life is improved in breast cancer patients by standardisd mistletoe extract PS76A2 during chemotherapy and follow-up: a randomized, placebo-controlled double-blind, multicantre clinical trial // Anticancer Res. – 2006. – Vol.26. – P.1519-1529.
- Siegle I.,Fritz P., McClellan M. et al. Combined cytotoxic action of viscum album agglutinin-1 and anticancer agents against human A549 lung cancer cells // Anticancer Res. – 2001. – Vol.21. – P.2687-2691.
- Solarogen I., Zhang J.H. The microRNA: small size, big value… // Surg.Neurol.Int. – 2010. – Vol.1. – P.1-6.
- Stauder H., Kreuser E.D. Mistletoe extracts standardized in terms of mistletoe lectins (ML-I) in oncology: current state of clinical research // Onkologie. – 2002. – Vol.25. – P.374-380.
- Stener-Vogt M.K., Bonkowsky V., Ambrosch P. et al. The effect of an adjuvant mistletoe treatment programe in resected head and neck cancer patients: a randomized controlled clinical trial // Eur.J.Cancer. – 2001. – Vol.37. – P.23-31.
- Tabiasco J., Pont F., Fournie J.J., Versellone A. Mistletoe viscotoxins increase natural killer cell-mediated cytotoxicity // Eur.J.Biochem. – 2002. – Vol.269. – P.2591-2600.
- Thies A., Pfuller H., Schancher M. et al. Binding of mistletoe lectins to cutaneous malignant melanoma: implication for prognosis and therapy // Anticancer Res. – 2001. – Vol.21. – P.2883-2888.
- Thies A., Nugel D., Pfuller H. et al. Influence of mistletoe lectins and cytokines induced by them on cell proliferation of human melanoma cells in vitro // Toxicology. – 2005. – Vol.207. – P.105-116.
- Thies A.,Dantel P., Meyer A. et al. Low-dose mistletoe lectin-1 reduces melanoma growth and spread in a scid mouse xenograft model // Br.J.Cancer. – 2008. – Vol.98. – P.106-112.
- Timoshenko A.V., Lan Y., Gabins H.J. Lada P.K. Immunotherapy of C3H/HeJ mammary adenocarcinoma with interleukin-2, mistletoe lectin or their combination. Effects on tumour growth, capillary leakage and nitric oxide (NO) production // Eur.J.Cancer. – 2001. – Vol.37. – P.1910-1920.
- Urech K., Bussing A., Thalmann G. et al. Antiproliferative effects of mistletoe (Viscum album L.) extract in urinary bladder carcinoma cell lines // Anticancer Res. – 2006. – Vol.26. – P.3049-3055.
- Valentiner U., Pfuller U., Baum C., Schumacher U. The cytotoxic effect of mistletoe lectins I, II and III on sensitive and multidrug resistant human colon cancer cell lines in vitro // Toxicology. – 2002. – Vol.171. – P.187-199.
- Van der Weg F., Strenli R.A. Use of alternative medicine by patients with cancer in rural area of Switzerland // Swiss.Med.Wkly. – 2003. – Vol.133. – P.233-240.
- Voss C., Eyol E., Frank M. et al. Identification and characterization of riproximin, a new type II ribosome inactivating protein with antineoplastic activity from ximenic Americana // FASEB J. – 2006. – Vol.20. – P.1194-1196.
- Wang V., Wu W. MicroRNA based therapeutics for cancer // Biodrugs. – 2009. – Vol.23. – P.15-23.
- Weber K., Mengs U., Schwarz T. et al. Effects of standardized mistletoe preparation on metastatic B16 melanoma colonization in murine lungs // Arzneimittelforschung. – 1998. – Vol.48. – P.497-502.
- Wode K., Schneider T., Lunberg I., Kienle S. Mistletoe treatment in cancer-related fatique: a case report // Cases J. – 2009. – Vol.2. – P.77.
- Yoon T.J., Joo Y.C., Choi O.B. et al. Inhibitory effect of Korean mistletoe (Viscum album coloratum) extracton tumor angiogenesis and metastasis of hematogenous and non-hematogenous tumor cells im mice // Cancer Lett. – 1995. – Vol.97. – P.83-91.
- Yoon T.J., Joo Y.C.,Kang T.B. et al. Lectins isolated from Korean mistletoe (Viscum album coloratum) induce apoptosis in tumor cells // Cancer Lett. – 1998. – Vol.136. – P.23-40.
- Yoon T.J., Joo Y.C.,Kang T.B. et al. Antitumor activity of the Korean mistletor lectin is attributed to activation of macrophages and NK-cells // Arch.Pharm.Res. – 2003. – Vol.26. – P.861-867.
- Zarkovic N., Zarkovic K., Grainca S. et al. The viscum album preparation Isorel inhibits the growth of melanoma B16F10 by influencing the tumour-host relationship // Anticancer Drugs. – 1997. – Vol.8. – Suppl.1. – P.17-22.
- Zarkovic N., Kalsnik T., Loncaric I. et al. Comparison of the effects of Viscum album lectin ML-I and fresh plant extract (Isorel) on the cell growth in vitro and tumorogenecity of melanoma B16F10 // Cancer Biother.Radiopharm. – 1998. – Vol.13. – P.121-131.
- Zarkovic N., Vucovic T., Lonaric I. et al. An overviewon anticancer activities of the Viscum album extract Isorel // Cancer Biother.Radiopharm. – 2001. – Vol.16. – P.55-62
- Zhang B., Pan X., Gobb G.P., Anderson T.A. MicroRNA as oncogenes and tumor supressors // Dev.Biol. – 2007. – Vol.302. – P.1-12.
- Ziegler R. Mistletoe preparation Iscador: are there methodological concerns with respect to controlled clinical trials // eCAM. – 2009. – Vol.6. – P.19-30.
- Ziegler R., Grossarth-Maticek R. Individual patient data meta-analysis of survival and psychosomatic selg-regulation from published prospective controlled cohort studies for long-term therapy of breast cancer patients with mistletoe preparation (Iscador) // eCAM. – 2010. – Vol.7. – P.157-166.
- Zuzak J.J., Eggeschwiller J., Grotzeb M.A., Viviani A. Pediatric medulloblastoma cells are susceptible to viscum album (mistletoe) preparations // Anticancer Res. – 2006. – Vol.26. – P.3485-3492.