УДК 616.44–006–078.4.

Ангиогенез и цифровая патология

Спринджук Матвей Владимирович^{1, 2}

¹ Объединенный институт проблем информатики Национальной академии наук Беларуси
ул. Сурганова, 6, 220012, г. Минск, Беларусь
² Автор для связи: Беларусь, 220040, Минск, Ул. Богдановича 112/38.
Электронная почта:

Аngiogenesis and digital pathology

Sprindzuk Matvey Vladimir^{1, 2}

¹ United Institute of Informatics Problems, National Academy of Sciences of Belarus
Surganov str., 6, 220012, Minsk, Belarus
Tel: +375-17-274-21-71
Fax: +375-17-331-84-03
² Corresponding author: Belarus, 220040, Minsk, Bogdanovicha lane 112/38.
Email:

---

Аннотация

В статье обсуждаются вопросы, касающиеся определения, классификации, патогенеза и регуляции ангиогенеза. Рассматриваются принципы кровоснабжения опухолей, его связь с течением и прогнозом болезни. Сообщаются принципы антиангиогенной фармакотерапии, перечисляются основные лекарственные средства этой группы, используемые в эксперименте с 1980 года. Особое внимание уделяется проблеме исследования микропрепарата опухолевых тканей с целью оценки степени активности ангиогенеза. На сегодняшний день «золотым стандартом» оценки активности процесса ангиогенеза является вычисление плотности микрососудов. Однако для исследования опухолей яичников этот метод является менее надежным, чем для опухолей других локализаций. Этот факт побуждает применять другие подходы к анализу изображений, такие как цветовая сегментация, а также синтаксический и фрактальный анализ. Возможно, комплексный анализ изображений вместе с клиническими параметрами пациентов позволит получить ясную патогенетическую картину изучаемого заболевания и расширит возможности дифференциальной диагностики, а также станет полезным инструментом для исследования антиангиогенной активности новых лекарственных средств.

Ключевые слова: ангиогенез, анализ изображений, антиангиогенная фармакотерапия, рак яичников.

Abstract

The questions relating to the definition, classification, pathogenesis and angiogenesis regulation are discussed. The principles of the tumor blood supply and its correlation to the development and prognosis of the malignant disease are described. The approaches of the antiangiogenic pharmacotherapy and the main drugs from this group are mentioned. The special attention is directed to the problem of the tumor specimen image analysis aimed to the assessment of the angiogenesis process activity. Today, the microvessel density calculation is considered the gold standard. However, for the ovarian cancer samples this approach lacks prognostic reliability. This fact stimulates further research and the application of alternative methods of image analysis, such as the color segmentation and the syntactic & fractal analyses. It is hoped that the complex image analysis in accord with the patient clinical parameters will allow an acquiring of the clear pathogenic picture, extension of the differential diagnosis spectrum and become a useful tool for effect evaluation of the novel antiangiogenic drugs.

Key words: angiogenesis, image analysis, antiangiogenic pharmacotherapy, ovarian cancer.

---

Определение ангиогенеза

Ангиогенез – образование новых капилляров из уже существующих – это необходимый компонент нормальных физиологических процессов, в том числе циклической функции яичников, заживления раневой поверхности и эмбрионального развития. Другое определение этого феномена: «ангиогенез – это стимуляция роста новых клеток сосудистого эндотелия и развитие новых кровеносных сосудов» [3].

Классификация ангиогенеза

Выделяют два типа ангиогенеза: разрастание, распускание сосудистой сети – «sprouting», и ремоделирование – «remodeling». Считается, что при опухолевом процессе доминирует первый тип [14, 15]. Однако Fox и соавт. (2007) [19] ремоделирование к ангиогенезу не относят. Они предложили выделять 5 разных типов неоваскуляризации опухолей:

1. Ангиогенез как рост новых капилляров из существующих сосудов;
2. Васкулярное ремоделирование – перестройка сосудистого русла;
3. Васкулогенез – образование сосудов de novo из предшественников эндотелиальных клеток, как это происходит в эмбрионе;
4. Гломерулоидный ангиогенез – образование клубочковых комплексов из капилляров, вариабельно разграниченных базальной мембраной и перицитами (тип характерен для глиобластом);
5. Васкулярная мимикрия – феномен образования целостной сети кровеносных капилляров, состоящих не из эндотелия, а преимущественно из опухолевых клеток.

Следует отметить, что все эти типы можно отнести к понятию «ангиогенез» в широком смысле слова, синонимом которого является «неоваскуляризация» как образование новых сосудов.

Значение ангиогенеза для кровоснабжения опухолей

Рост солидных опухолей витально зависит от ангиогенеза, так как опухолевые клетки не могут вырасти больше 1-2 мм в диаметре без образования новых сосудов для доставки питательных веществ, кислорода и удаления продуктов обмена веществ (Аmano и соавт., 2007; Plendl, 2000; Бурлев В.А., 2006) [1, 9-12, 25, 37-40, 49].

Фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС)

ФРЭС-A (англ. – Vascular endothelial Growth Factor – VEGF-A, синоним – «сосудистый эндотелиальный фактор роста», «сосудистый эндотелиальный ростовой фактор») – гепарин-связывающий гликопротеин, который встречается, по меньшей мере, в четырех молекулярных изоформах, что является результатом альтернативных вариантов сплайсинга мРНК ФРЭС. Senger и колл. в 1993 году впервые выделили его из опухолевой асцитической жидкости грызунов. Позже ФРЭС обнаружили в злокачественном транссудате при клиническом течении различных опухолей. Сегодня ФРЭС рассматривается как многофункциональный цитокин, обладающий мощной митогенной активностью [3].

Маркеры кровеносных сосудов

Среди множества маркеров для иммуногистохимической окраски сосудов чаще всего используются антиген фактора VIII, CD31/PECAM-1 и СD34. Антиген фактора VIII формирует часть комплекса вон Виллебранда и участвует в процессах коагуляции. Молекула адгезии клетки тромбоцита к эндотелию CD31 (PECAM – platelet-endothelial adhesion molecule) – это трансмембранный гликопротеин, вовлекаемый в процессы клеточной адгезии. СD34 – это гликопротеин поверхности клеток, функция которого неизвестна [3].

Кровоснабжение ткани в норме и при опухолевом процессе

Сосуды злокачественного новообразования отличаются от нормальной аналогичной ткани, прежде всего архитектурой: они имеют беспорядочную форму, расширены и извиты и часто слепо заканчиваются. Другие их свойства – распространенная окончатость, аномальная базальная мембрана и необычно широкие промежутки между прилегающими эндотелиальными клетками, что делает капилляры излишне проницаемыми.

Маркеры ангиогенеза могут располагаться как внутри просвета сосудов, так и снаружи его. Белки внеклеточного матрикса преимущественно располагаются снаружи просвета капилляра, что, вероятно, нарушает их доступность через кровеносное русло. Маркеры, находящиеся внутри просвета сосуда, легче доступны для веществ, циркулирующих в крови, их меньше и они менее стабильны (Brack, Dinelborg & Neri, 2007) [7].

Регуляция ангиогенеза

Процесс ангиогенеза регулируется цитокинами, ростовыми факторами, взаимодействием эндотелиальных клеток между собой и компонентами экстрацеллюлярного матрикса и с клетками микроокружения: макрофагами, гладкомышечными клетками, фибробластами (см. таб.1). Начальные процессы, течение и завершение ангиогенеза зависят от баланса про- и антиангиогенных факторов в микроокружении эндотелиальных клеток. Ангиогенез можно представить в виде сменяющих друг друга этапов. Для опухоли – это путь от покоящейся эндотелиальной клетки к развитию сети сосудов, обеспечивающих многогранный обмен веществ [15] и далее до метастазирования и гибели больного (см. рис.1). Критический момент перехода от фенотипа покоящейся клетки к активно размножающейся называется «angiogenic switch» (включение механизмов ангиогенеза) [17].

Таблица 1. Ключевые регуляторы ангиогенеза (по Merrit & Sood, 2007) [32].

Активаторы

Ингибиторы

Сосудисто-эндотелиальный фактор роста Фактор роста фибробластов, основной и кислый (FGF) Трансформирующий фактор роста-бета Фактор роста эпидермиса Фактор роста, выделенный из тромбоцитов Фактор некроза опухолей альфа Интерлейкин-8 Интерлейкин-6 Ангиопоэтин 1,2 Циклооксигенза-2 Катехоламины Индуцируемый гипоксией фактор-1-альфа Матрикс металлопротеиназ Эфрины/рецепторы эфринов Пролактин Ангиогенин

Тромбопластин Ангиостатин Эндостатин N-терминальные фрагменты пролактина Интерферон альфа Интерлейкин-12 Вазостатин Гормон роста Допамин

Рис.1. Каскад развития опухоли и значение ангиогенеза.

Стадии ангиогенеза

Можно выделить следующие этапы ангиогенеза:

1. Деградация и фрагментация базальной мембраны эндотелиальных клеток существующего сосуда под воздействием металлопротеаз.
2. Миграция эндотелиальных клеток в строму и протеолитическая деградация экстрацеллюлярного матрикса.
3. Пролиферация эндотелиальных клеток; формирование новых капиллярных трубок, слияние сформированных сосудов и развитие сети анастомозов между ними.
4. Угнетение пролиферации и миграции эндотелиальных клеток под влиянием антиангиогенных факторов: TGFbeta, IL-12, IFNgamma, IFNalpha
   (По Солодовниковой Н.Г., Ниаури Д.А., Бурлеву В.А., 2003-2005 с доп.; Amis и соавт., 2005; Brack, Dinkelberg & Neri, 2004; Turner и соавт., 2003) [2, 7, 43-45].

Оценка степени активности ангиогенеза на гистологическом препарате

Ангиогенез можно рассматривать как на уровне организма пациента, так и на уровнях системы органов, индивидуального органа, тканей и отдельных клеток. Ангиогенез на микропрепарате оценивается либо глазом врача-патолога, масштабной сеткой (graticule) и с помощью стереологических методов, либо с помощью программного обеспечения (Goddard и соавт., 2002) [18, 20, 28]. Как правило, обработка изображений, по которому оценивается степень ангиогенеза, проходит несколько этапов (см. рис.2) [4].

Рис.2. Этапы обработки изображений ангиогенеза [4].

Первый метод количественной оценки ангиогенеза на примере неоваскуляризации опухолей мозга предложил Brem (1972) [41].

Изначально количественной оценкой ангиогенеза на гистологическом срезе органа являлась площадь сосудов (vessel area), окрашенная красителем [36] или иммуноцитохимическим методом. Поиск надежных биомаркеров ангиогенеза продолжается и сегодня [8, 16, 26, 32, 46] и вместе с этим направлением предлагаются новые критерии оценки изображений ангиогенеза, полученных в результате сложного процесса приготовления микропрепарата изучаемой ткани. На сегодняшний день наибольшее распространение среди параметров оценки ангиогенеза получил показатель плотности микрососудов (microvessel density), определяемой в точках максимальной васкуляризации («горячих точках» – hot spots). Этот подход считается «золотым стандартом» оценки активности ангиогенеза в тканях опухолей [20, 21, 23, 30, 32, 48]. Его авторы, Weidner и коллабораторы, разработали и применили эту методику для исследования карцином молочной железы и простаты в начале девяностых годов [41].

Ангиогенез (измеренный как плотность микрососудов опухоли) коррелирует с поведением опухоли (см. таб.2). Имеются факты о том, что интенсивность ангиогенеза ассоциируется с развитием метастазов, плохим прогнозом, в том числе уменьшением срока выживаемости у пациентов, страдающих карциномой молочной железы, мочевого пузыря, желудка (Turner и соавт., 2003) [45]. Что касается исследования ангиогенной активности в тканях эпителиального рака яичников, то в этой области сообщаются противоречивые сведения о значении плотности микрососудов как предсказательном факторе клинического прогноза и критерии дифференциальной диагностики. Bamberger & Perret (2002) пришли к заключению, что экспрессия ФРЭС и анализ плотности микрососудов для оценки васкуляризации эпителиальной карциномы яичников не являются настолько полезными для предсказания прогноза, как при исследовании карциномы молочной железы, и что не наблюдается четкой корреляции между значением плотности микрососудов и возрастом, степенью дифференциации опухоли, ее размерами, асцитом, ростом опухоли, причем наблюдаются колебания этой зависимости для различных гистологических подтипов рака яичников [3]. Дальнейшие исследования также выявили аналогичные противоречия (см. таб.2) [32]. Можно предположить, что разные выводы исследований обусловлены разнородностью генотипов обследуемых пациентов в ракурсе экспрессии сосудистых биомаркеров либо гетерогенностью микропрепаратов.

Таблица 2. Обзор исследований, в которых применялся анализ плотности микрососудов у пациентов, страдающих раком яичника (по Merrit & Sood, 2007) [32].

Автор	Год	Число пациентов	Метод	Ассоциируемый исход исследования
Hollingsworth и соавт.	1995	45	CD-34	ОВ и выживаемость без данного заболевания (disease free)
Abulafia и соавт.	1997	49*	Aнтиген фактора VIII	ОВ (только у пациентов с метастазами сальника)
Alvarez и соавт.	1999	87	vWF&CD31	ОВ и стадия болезни
Heimburg и соавт.	1999	38	CD34	ОВ
Obermair и соавт.	1999	63	CD34	ОВ
Stone и соавт.	2003	202	CD31	ОВ, стадия, степень рака, потенциал циторедукции
Chan и соавт.	2004	46	CD34	Возраст и ОВ
Raspolini и соавт.	2005	33	CD34**	ОВ и ответ на лечение
Karavasilis и соавт.	2006	33	CD34	Нет связи между явлениями
Lin и соавт.	2006	77	СD31	Стадия, асцит, потенциал уровня циторедукции

Стадия (stage) рака описывает распространение злокачественного процесса, а степень (grade) – гистологические характеристики дифференциации опухоли [3].

ОВ – общая выживаемость
*- в этой группе 19 пациентов имели метастазы в сальник;
** – в этой группе применялся компьютер-ассистированный анализ изображений
vWF – фактор вон Виллебранда.

О недостатках и ограничениях метода определения плотности микрососудов в «горячих точках» высказывались Weidner (1995) [47] и Brown (2008) [8]. Последний на основе личных наблюдений и анализа исследований других ученых пришел к выводу, что этот метод не может применяться для точной оценки активности ангиогенеза в широкомасштабных клинических исследованиях. Таким образом, недостатки «золотого стандарта» оценки процессов ангиогенеза заставляют искать и оценивать новые критерии анализа изображений микропрепаратов окрашенных капилляров.

Альтернативным подходом к количественной оценке ангиогенеза является подсчет микрососудов в случайно (рандомизированно) выбранных областях изображений или в специфически определенных регионах, таких как края опухоли. Дают ли оба названные методы одинаковую биологическую информацию и лучше ли они других методов – этот вопрос открыт для дискуссии (Kim и соавт., 2003, in «An original approach…»).

Помимо самой плотности микрососудов может вычисляться и среднее значение пропорции поверхности микрососудов (mean microvessel surface proportions), а также фракция площади сосудов (vascular area fraction), абсолютное число микрососудов и их периметр, длины и площади определенных категорий капилляров. (Kim и соавт., 2003, in «An original approach…»; Olewniczak и соавт., 2003; Karnabatidis и соавт., 2001) [27, 28, 34].

Когда вычисляется плотность микрососудов, отдельный объект, прокрашенный, например, маркером CD34, регистрируется как один сосуд. Считается, что по своей природе иммунохимическое окрашивание сосудов не является идеальным для диагностических целей, так как при такой окраске прилегающие сосуды и даже группа сосудов могут быть распознаны как один объект (Goddard и соавт., 2002) [20, 21].

После бинаризации изображений плотность микрососудов оценивается путем подсчета общего числа белых пикселей на определенном поле. Такие показатели, как среднее число концевых точек капилляров (vessel end points), узловых точек разветвления на каждом изображении (vessel branch points/nodes), средняя общая длина сосудов для данного изображений в пикселях, вычисляются после скелетонизации изображений (Аmano и соавт., Japan, 2007) [1].

Объектом измерения ангиогенеза программы AngioQuant (программного обеспечения, доступного бесплатно для научно-исследовательских целей по адресу www.cs.tut.fi) является сеть соединенных трубчатых (тубулярных) структур капилляров. Это программное обеспечение позволяет определять длину и размеры этих тубулярных комплексов, также как и число соединений (точек ветвления) в самом комплексе (Antti Niemisto, Finland, 2005) [33]. Исследователи, разработавшие это программное обеспечение, пришли к выводу, что распределение длин тубулярных комплексов в экспериментальном ангиогенезе подчиняется закону степени (power law).

В своих статьях об измерении ангиогенеза посредством анализа изображений препаратов мембраны эмбриона цыпленка и аортального кольца крысы Blacher и соавт. (2001, 2005) [5, 6] упоминают такие характеристики оценки ангиогенеза, как плотность длины сосудов (vessel length density), в частности, радиально расположенных капилляров, размеры фракций капилляров (fractial dimension), средний диаметр капилляра.

Другие подходы к оценке изображений ангиогенеза – это анализ цветов полученного изображений, цветовая сегментация изображений (сolor segmentation), сравнение цветов пикселей (pixel colour comparisson), анализ текстуры изображений гистологического препарата (Rodriguez и соавт., 2002; Laitakari, 2003) [29, 42]. Последний метод характеризует энтропию, корреляцию и контраст изображений.

Интересный подход к анализу гистологического препарата ангиогенеза – применение фрактального и синтаксического анализа (fractal & syntactic analysis) c применением спектра дескрипторов, многогранно описывающих объекты изображений (Grizzi и соавт., 2005) [22].

Вероятно, анализ плотности (денситометрия), который уже весьма широко применяется для анализа ДНК [24, 31], может найти свое место для обработки изображений, выражая меру развития процесса распространения сосудов в опухолевой ткани. Возможно, объектом исследования может стать мРНК ФРЭС.

Спектральный анализ применяется для интерпретации изображений, полученных с помощью микроскопа, с конца девяностых годов [35], однако в литературе опыт применения этой технологии для вопросов ангиогенеза в такой модальности не упоминается.

Вопросы разработки эффективной антиангиогенной терапии

Четкой целью всего спектра исследований ангиогенеза является разработка и применение эффективных лекарственных средств. Более 500 000 000 жителей планеты нуждаются в коррекции процессов ангиогенеза в организме. Первыми исследователями антиангиогенной терапии считаются Judah Folkman и Napoleone Ferrara из лаборатории Гарварда (Бостон, США, см. таб.3) [13, 41].

Таблица 3. Ингибиторы ангиогенеза,
разработанные в лаборатории Фолькмана за период 1980-2005 гг. [41].

1980	Интерферон альфа-бета
1982	Протамин / 4-й тромбоцитарный фактор
1985	Ангиостатические стероиды
1990	Фумагиллин
1994	Ангиостатин
1994	Талидомид
1994	1-метилокстиэстрадиол
1997	Эндостатин
1999	Расщепленный антитромбин III
2002	3-Аминотолидомид
2003	DBF-maf
2005	Каплостатин

Стратегии терапевтического влияния на ангиогенез разделяются на три группы по механизму воздействия на активность процесса (см. рис.3) [15].

Рис.3. Стратегии терапевтического влияния на ангиогенез [15].

Заключение

Проблема ангиогенеза в медицине затрагивает такие технологические аспекты, как разработка и применение новых способов окраски микропрепаратов васкуляризированных тканей, создание надежных точных методов распознавания клеточной структуры окрашенного и обработанного другими методиками среза органа. Открытие новых маркеров эндотелия позволило создать иммунохимические реактивы для четкой визуализации интересуемых сосудистых структур, а количественный анализ этих изображений с помощью ЭВМ дает беспристрастную стабильную оценку, которая служит доказательной основой научных выводов и концепций.

Имеется необходимость изучения и сравнения прогностических возможностей методов анализа изображений микропрепарата ангиогенеза, таких как фрактальный и так называемый синтактический анализ (syntactic analysis) и определение плотности микрососудов. Вероятно, комплексный анализ изображений вместе с клиническими параметрами пациентов позволит получить более ясную патогенетическую картину изучаемого заболевания и расширит возможности дифференциальной диагностики, а также послужит полезным инструментом для исследования антиангиогенной активности новых лекарственных средств.

Список литературы

1. Amano M., Suzuki M., Andoh S., Monzen H., Terai K., Williams B., Song C.W., Mayo K.H., Hasegawa T., Dings R.P., Griffin R.J. Antiangiogenesis therapy using a novel angiogenesis inhibitor, anginex, following radiation causes tumor growth delay // Int J Clin Oncol. – 2007. – Vol. 12, № 1. – P. 42-47.
2. Amis S.J., Coulter-Smith S.D., Crow J.C., Maclean A.B., Perrett C.W. Microvessel quantification in benign and malignant ovarian tumors // Int J Gynecol Cancer. – 2005. – Vol. 15, № 1. – P. 58-65.
3. Bamberger E.S., Perrett C.W. Angiogenesis in epithelian ovarian cancer // Mol Pathol. – 2002. – Vol. 55, № 6. – P. 348-359.
4. Bensebaa K., Suzim A. Image Analysis in Histological Sections. Segmentation and Quantification of Tumor Angiogenesis Areas. – Vol. 1, №. Р. 122-131.
5. Blacher S., Devy L., Burbridge M., Roland G., Tucker G., Noлl A., Foidart J. Improved quantification of angiogenesis in the rat aortic ring assay // Angiogenesis. – 2001. – Vol. 4, № 2. – P. 133-142.
6. Blacher S., Devy L., Hlushchuk R., Larger E., Lamandй N., Burri P., Corvol P., Djonov V., Foidart J., NOЛL A. Quantification of angiogenesis in the chicken chorioallantoic membrane (CAM) // Image Anal Stereol. – 2005. – Vol. 24, №. – P. 169-180.
7. Brack S.S., Dinkelborg L.M., Neri D. Molecular targeting of angiogenesis for imaging and therapy // Eur J Nucl Med Mol Imaging. – 2004. – Vol. 31, № 9. – P. 1327-1341.
8. Brown A.P., Citrin D.E., Camphausen K.A. Clinical biomarkers of angiogenesis inhibition // Cancer Metastasis Rev. – 2008. – Vol. 27, № 3. – P. 415-434.
9. Burlev V. ll'yasova NA, Dubinskaya ED. Proliferative activity of microvessels and angiogenesis in eutopic endometrium in patients with peritoneal endometriosis // Bull Exp Biol Med. – 2005. – Vol. 139, № 6. – P. 727-731.
10. Burlev V., Dubinskaya E., Ilyasova N., Gavrilova T., Adamyan L. Markers of angiogenesis in the blood serum and peritoneal fluid in patients with adenomiosis // PROBLEMY REPRODUKTSII. – 2006. – Vol. 12, № 2. – P. 55.
11. Burlev V., Gasparov A., Dubinskaya E., Ilyasova N. Variants of angiogenic activity of peritoneal endometriosis and infertility treatment efficacy // Problemy Reproduktsii. – 2008. – Vol. 14, № 2. – P. 53.
12. Burlev V., Il’yasova N., Dubinskaya E. Proliferative activity of microvessels and angiogenesis in eutopic endometrium in patients with peritoneal endometriosis // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. – 2005. – Vol. 139, № 6. – P. 727-731.
13. Cao Y., Langer R. A review of Judah Folkman's remarkable achievements in biomedicine // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2008. – Vol. 105, № 36. – P. 13203-13205.
14. Carmeliet P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis // Nature medicine. – 2000. – Vol. 6, № 4. – P. 389-395.
15. Carmeliet P., Jain R. Angiogenesis in cancer and other diseases // Nature. – 2000. – Vol. 407, № 6801. – P. 249-257.
16. De Wever O., Derycke L., Hendrix A., De Meerleer G., Godeau F., Depypere H., Bracke M. Soluble cadherins as cancer biomarkers // Clin Exp Metastasis. – 2007. – Vol. 24, № 8. – P. 685-697.
17. Folkman J. A new link in ovarian cancer angiogenesis: lysophosphatidic acid and vascular endothelial growth factor expression // J Natl Cancer Inst. – 2001. – Vol. 93, № 10. – P. 734-735.
18. Fox S. Tumour angiogenesis and prognosis // Histopathology. – 1997. – Vol. 30, № 3. – P. 294.
19. Fox S.B., Generali D.G., Harris A.L. Breast tumour angiogenesis // Breast Cancer Res. – 2007. – Vol. 9, № 6. – P. 216.
20. Goddard J.C., Sutton C.D., Furness P.N., Kockelbergh R.C., O'Byrne K.J. A computer image analysis system for microvessel density measurement in solid tumours // Angiogenesis. – 2002. – Vol. 5, № 1-2. – P. 15-20.
21. Goddard J.C., Sutton C.D., Furness P.N., O'Byrne K.J., Kockelbergh R.C. Microvessel density at presentation predicts subsequent muscle invasion in superficial bladder cancer // Clin Cancer Res. – 2003. – Vol. 9, № 7. – P. 2583-2586.
22. Grizzi F., Russo C., Colombo P., Franceschini B., Frezza E.E., Cobos E., Chiriva-Internati M. Quantitative evaluation and modeling of two-dimensional neovascular network complexity: the surface fractal dimension // BMC Cancer. – 2005. – Vol. 5, №. – P. 14.
23. Hardee M.E., Cao Y., Fu P., Jiang X., Zhao Y., Rabbani Z.N., Vujaskovic Z., Dewhirst M.W., Arcasoy M.O. Erythropoietin Blockade Inhibits the Induction of Tumor Angiogenesis and Progression // PLoS ONE. – 2007. – Vol. 2, № 6.
24. Hardie D., Gregory T., Hebert P. From pixels to picograms: a beginners' guide to genome quantification by Feulgen image analysis densitometry // Journal of Histochemistry and Cytochemistry. – 2002. – Vol. 50, № 6. – P. 735.
25. Jung Y.D., Ahmad S.A., Liu W., Reinmuth N., Parikh A., Stoeltzing O., Fan F., Ellis L.M. The role of the microenvironment and intercellular cross-talk in tumor angiogenesis // Semin Cancer Biol. – 2002. – Vol. 12, № 2. – P. 105-112.
26. Karathanasis E., Chan L., Karumbaiah L., McNeeley K., D'Orsi C.J., Annapragada A.V., Sechopoulos I., Bellamkonda R.V. Tumor Vascular Permeability to a Nanoprobe Correlates to Tumor-Specific Expression Levels of Angiogenic Markers // PLoS ONE. – 2009. – Vol. 4, № 6.
27. Karnabatidis D., Dimopoulos J., Siablis D., Papazafiropoulos D., Kalogeropoulou C., Nikiforidis G. Quantification of the ionising radiation effect over angiogenesis in the chick embryo and its chorioallantoic membrane by computerised analysis of angiographic images // Acta Radiologica. – 2001. – Vol. 42, № 3. – P. 333-338.
28. Kim N., Elie N., Plancoulaine B., Herlin P., Coster M. An original approach for quantification of blood vessels on the whole tumour section // Analytical cellular pathology. – 2003. – Vol. 25, № 2. – P. 63-75.
29. Laitakari J. Computer-assisted Quantitative Image Analysis of Cell Proliferation, Angiogenesis and Stormal Markers in Experimental and Laryngeal Tumor Development. – Oulun yliopisto, 2003.
30. Lee J.S., Kim H.S., Jung J.J., Kim Y.B., Lee M.C., Park C.S. Expression of vascular endothelial growth factor in invasive ductal carcinoma of the breast and the relation to angiogenesis and p53 and HER-2/neu protein expression // Appl Immunohistochem Mol Morphol. – 2002. – Vol. 10, № 4. – P. 289-295.
31. Mendelsohn M., Mayall B. Chromosome identification by image analysis and quantitative cytochemistry // Human Chromosome Methodology. – 1974. – Vol., №. – P. 311.
32. Merritt W.M., Sood A.K. Markers of angiogenesis in ovarian cancer // Dis Markers. – 2007. – Vol. 23, № 5-6. – P. 419-431.
33. Niemisto A., Dunmire V., Yli-Harja O., Zhang W., Shmulevich I. Robust quantification of in vitro angiogenesis through image analysis // IEEE Trans Med Imaging. – 2005. – Vol. 24, № 4. – P. 549-553.
34. Olewniczak S., Chosia M., Kolodziej B., Kwas A., Kram A., Domagala W. Angiogenesis as determined by computerised image analysis and the risk of early relapse in women with invasive ductal breast carcinoma // Pol J Pathol. – 2003. – Vol. 54, № 1. – P. 53-59.
35. Ornberg R., Woerner B., Edwards D. Analysis of stained objects in histological sections by spectral imaging and differential absorption // Journal of Histochemistry and Cytochemistry. – 1999. – Vol. 47, № 10. – P. 1307.
36. Parke A., Bhattacherjee P., Palmer R.M., Lazarus N.R. Characterization and quantification of copper sulfate-induced vascularization of the rabbit cornea // Am J Pathol. – 1988. – Vol. 130, № 1. – P. 173-178.
37. Plendl J. Angiogenesis and Vascular Regression in the Ovary* // Anatomia, Histologia, Embryologia. – 2000. – Vol. 29, № 5. – P. 257-266.
38. Plendl J. Angiogenesis and vascular regression in the ovary // Anat Histol Embryol. – 2000. – Vol. 29, № 5. – P. 257-266.
39. Plendl J., Snyman C., Naidoo S., Sawant S., Mahabeer R., Bhoola K.D. Expression of tissue kallikrein and kinin receptors in angiogenic microvascular endothelial cells // Biol Chem. – 2000. – Vol. 381, № 11. – P. 1103-1115.
40. Qutub A., Gabhann F., Karagiannis E., Vempati P., Popel A. Multiscale models of angiogenesis // IEEE Eng Med Biol Mag. – 2009. – Vol. 28, № 2. – P. 14-31.
41. Ribatti D. Judah Folkman, a pioneer in the study of angiogenesis // Angiogenesis. – 2008. – Vol. 11, № 1. – P. 3-10.
42. Rodrнguez-Manzaneque J., Lane T., Ortega M., Hynes R., Lawler J., Iruela-Arispe M. Thrombospondin-1 suppresses spontaneous tumor growth and inhibits activation of matrix metalloproteinase-9 and mobilization of vascular endothelial growth factor // Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2001. – Vol. 98, № 22. – P. 12485.
43. Sel’kov S., Solodovnikova N., Pavlov O., Niauri D. Local production of interleukins and growth factors in external genital endometriosis // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. – 2005. – Vol. 139, № 4. – P. 444-447.
44. Sokolov D., Solodovnikova N., Pavlov O., Niauri D., Volkov N., Sel'kov S. Study of cytokine profile and angiogenic potential of peritoneal fluid in patients with external genital endometriosis // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. – 2005. – Vol. 140, № 5. – P. 541-544.
45. Turner H.E., Harris A.L., Melmed S., Wass J.A. Angiogenesis in endocrine tumors // Endocr Rev. – 2003. – Vol. 24, № 5. – P. 600-632.
46. Virostko J., Xie J., Hallahan D.E., Arteaga C.L., Gore J.C., Manning H.C. A Molecular Imaging Paradigm to Rapidly Profile Response to Angiogenesis-directed Therapy in Small Animals // Mol Imaging Biol. – 2009. – Vol. 11, № 3. – P. 204-212.
47. Weidner N. Intratumor microvessel density as a prognostic factor in cancer // Am J Pathol. – 1995. – Vol. 147, № 1. – P. 9-19.
48. Wild R., Ramakrishnan S., Sedgewick J., Griffioen A. Quantitative assessment of angiogenesis and tumor vessel architecture by computer-assisted digital image analysis: effects of VEGF–toxin conjugate on tumor microvessel density // Microvascular Research. – 2000. – Vol. 59, № 3. – P. 368-376.
49. Миронов В.А., Миронов А.А., Гурина О.Ю. Ангиогенез. Образование, рост и развитие кровеносных сосудов. – М.: НИО "Квартет", 1993, – 170 с., 115 л. ил.

Работа выполнена в рамках проектов CRDF-4028, МНТЦ-1682.