Метод атомно-силовой микроскопии
в диагностике заболеваний молочной железы

Чиссов В.И., Решетов И.В., Волченко Н.Н., Славнова Е.Н., Сухарев С.С.

ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им П.А. Герцена»,
ФГОУ ИПК ФМБА, Москва, Россия

Исследование выполнено в рамках Государственного контракта от «19» апреля 2011 г. №16.513.11.3069 федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы».

Опубликовано: Журнал «Онкохирургия», 2012, том 4, №1.

Цель исследования – поиск объективных критериев дифференциальной диагностики между нормальными клетками и клетками рака молочной железы, определение степени дифференцировки рака молочной железы, объективизация оценки иммуноцитохимической реакции гиперэкспрессии онкопротеина Неr2/neu.

Материалы и методы. Материалом исследования послужили жидкостные и рутинные цитологические препараты различных заболеваний молочной железы от 51 больной. Препараты окрашивали азур-эозиновыми смесями. Оценивалась степень экспрессии онкобелка Her2/neu (CerbB-2) на 10 иммунноцитохимических препаратах рака молочной железы. Иммуноцитохимию проводили методом Ultra Vision. Для исследования использовали атомно-силовой микроскоп, входящий в исследовательский комплекс Интегра производства «ЗАО НТ НДТ» г. Зеленоград.

Результаты исследования. Методом атомно-силовой микроскопии определен объективный показатель дифференциальной диагностики фиброаденомы и инвазивного протокового рака молочной железы. Соотношение высоты ядра и цитоплазмы является объективным критерием дифференциальной диагностики ФА и рака молочной железы (при раке – 3.2±1, при ФА – 1.8±0.4).

Определены средние значения отношений высот ядер к высоте цитоплазмы для рака молочной железы при различных степенях дифференцировки (низкая – 3.2, умеренная – 3.7, высокая – 2.9) . Получены объективные различия в размерах и форме ядрышек для рака молочной железы разной степени дифференцировки.

Методом атомно-силовой микроскопии проведена оценка интенсивности иммуноцитохимической реакции по высоте окрашенной мембраны. При гиперэкспрессии Неr2/neu определено максимальное возвышение мембраны клеток рака молочной железы на 850 нм.

Выводы. Новый метод АСМ позволяет определить объективные дифференциально-диагностические критерии между фиброаденомой и инвазивным протоковым раком. Для клеток рака характерно увеличение соотношения высоты ядра и цитоплазмы.

Получены объективные критерии определения степени дифференцировки рака МЖ. Важным показателем степени дифференцировки рака молочной железы могут служить структура и размеры ядрышек.

АСМ позволяет дополнительно оценивать результаты иммуноцитохимической реакции. В нашем исследовании гиперэкспрессия Her2/neu при АСМ проявлялась в виде четкого замкнутого возвышения цитоплазмы высотой 850 нм.

Ключевые слова: атомно-силовая микроскопия, рак молочной железы, фиброаденома, иммуноцитохимия.

Atomic force microscopy in the diagnosis of breast pathology

Chissov V.I.¹, Reshetov I.V.¹, Volchenko N.N.¹, Slavnova E.N.¹, Sukharev S.S.²

1) P.A. Herzen Moscw Cancer Research Institute
2) FSI Institute of advanced training of FMBA of Russia

The article was accomplished under the State Contract of April, 19 2011 № 16.513.11.3069 as part of Federal grant program «Investigations and development for priority orientations of Russian technology research complex for 2007-2012».

The objective – to determine objective criteria for differential diagnosis between normal cells and breast cancer cells, to determine the level of differentiation of breast cancer, objectivation of assessment of immunocytochemical reaction of hyperexpression of Her2/neu oncoprotein.

Materials and methods. We used liquid and routine cytological specimens of different breast diseases in 51 female patients. The specimens were stained by eosin mixtures. The level of Her2/neu (CerbB-2) oncoprotein expression on 10 immunocytochemical specimens of breast cancer was determined. Immunocytochemical studies were performed by Ultra Vision method. For investigation we used atomic force microscope in study complex Integra by NT-MDT of Zelenograd.

Results. By atomic force microscopy objective criterion for differential diagnosis of fibroadenoma and invasive ductal breast cancer was determined. The objective criteria for differential diagnosis of fibroadenoma and breast cancer may be the ratio between height of nucleus and cytoplasm (for cancer – 3.2±1, for fibroadenoma – 1.8±0.4).

The mean ration between height of nucleus and cytoplasm for different levels of differentiation was found (low – 3.2, moderate – 3.7, high – 2.9). There were significant differences in size and shape of nucleoli for breast cancer of different differentiation levels.

Using atomic force microscopy the rate of immunocytochemical reaction by height of stained membrane was evaluated. For Неr2/neu hyperexpression the maximal prominence of membrane of breast cancer cells was 850 nm.

Conclusion. New method of AFM allows determining objective differential and diagnostic criteria for fibroadenoma and invasive ductal cancer. For breast cancer the ration between height of nucleus and cytoplasm increases.

The objective criteria for level of breast cancer differentiation were determined. The important markers of breast cancer differentiation may be the structure and size of nucleoli.

Atomic force microscopy allows determining results of immunocytochemical reactions. For atomic force microscopy Her2/neu hyperexpression was represented as well-defined closed prominence of cytoplasm 850 nm in height.

Key words: atomic force microscopy, breast cancer, fibroadenoma, immunocytochemistry.

---

Введение

Использование атомно-силовой микроскопии (АСМ) открывает новые возможности в цитологической диагностике, поскольку метод за небольшое время (минуты) позволяет получить изображение поверхности клеток с разрешением порядка нескольких нанометров [3, 8, 9]. Физической основой работы АСМ служит взаимодействие между острием зонда, сканирующего исследуемый образец, и поверхностью [4]. В процессе сканирования зонд движется строка за строкой по изучаемому образцу. При этом острие зонда приподнимается и опускается, очерчивая микрорельеф поверхности образца.

АСМ обладает рядом преимуществ, что дает возможность применять этот метод в цитологии [1, 2, 5, 6, 7, 10, 11, 12]. Во-первых, АСМ позволяет изучать структуру и разнообразные свойства поверхностей в различных средах с высоким пространственным разрешением, порядка нескольких нанометров (7-8 нм), за небольшое время (минуты). Во-вторых, при АСМ получают трехмерное изображение клеток и макромолекул на их поверхности. В-третьих, с помощью АСМ исследуют поведение макромолекул и живых клеточных систем в условиях, приближенных к физиологическим. Спектральные исследования, проводимые с помощью АСМ, дают информацию о химическом составе исследуемого объекта. Кроме того, возможно детектирование физических свойств исследуемых поверхностей.

Материалы и методы исследования

Материалом исследования послужил 51 цитологический препарат опухолей молочной железы, полученных методом тонкоигольной аспирационной биопсии под контролем ультразвукового исследования и с помощью соскобов с операционного материала. Методом АСМ можно исследовать как рутинные цитологические мазки, так и жидкостные монослойные препараты, окрашенные азур-эозиновыми смесями.

Для объективизации данных ИЦХ о степени экспрессии онкобелка Her2/neu (CerbB-2) исследовали 10 иммунноцитохимических препаратов рака молочной железы. Иммуноцитохимию проводили методом Ultra Vision. Все препараты исследовались с помощью обычной световой микроскопии, а затем с помощью АСМ.

Для исследования использовали атомно-силовой микроскоп, входящий в исследовательский комплекс Интегра производства «ЗАО НТ НДТ» (г. Зеленоград, Россия). Сканирование осуществляли в полуконтактном режиме. Полученные данные микрорельефа поверхностей клеток и его локальных свойств обрабатывали штатными программными средствами, входящими в состав программного обеспечения исследовательского комплекса Интегра.

Результаты исследования и их обсуждение

Выделены три задачи цитологической диагностики, в решении которых АСМ может оказать цитологу дополнительную помощь при патологии молочных желез:

1. Поиск объективных критериев дифференциальной диагностики между нормальными клетками и клетками рака молочной железы (МЖ).
2. Определение степени дифференцировки рака МЖ.
3. Объективизация иммуноцитохимической реакции (ИЦХ) гиперэкспрессии онкопротеина Неr2/neu.

Первая задача – поиск объективных критериев дифференциальной диагностики между нормальными клетками и клетками рака молочной железы.

Рутинная цитограмма наиболее распространенного (80%) инвазивного протокового рака молочной железы представлена полиморфными клетками с гиперхромными ядрами, с увеличенными полиморфными ядрышками, грубой неравномерной структурой хроматина (рис. 1). Отмечается тенденция клеток к разрозненному расположению, а также к образованию железистоподобных структур. Они в наибольшей мере отражают реальную форму и поверхностные свойства клеток.

Рис. 1. Рутинная цитограмма инвазивного протокового рака молочной железы.
Окр. по Паппенгейму. Ув. ×400.

При проведении АСМ в клетках инвазивного протокового рака молочной железы наблюдается грубый микрорельеф поверхности ядер, ядрышки хорошо просматриваются в виде локальных возвышений, ядерно-цитоплазменное соотношение сдвинуто в сторону ядра (рис. 2). Контуры ядра и цитоплазмы неровные. Высота ядра составляет 742±143 нм. Высота цитоплазмы – 248±94 нм, отношение высоты ядра к высоте цитоплазмы составляет 3.2±1.0 Высота ядрышек над поверхностью ядра – 151±90 нм.

Рис. 2. АСМ изображение клеток рака молочной железы.

Фиброаденома (ФА) – одна из наиболее распространенных доброкачественных опухолей молочной железы, при которой иногда трудно провести дифференциальную диагностику, особенно у женщин пременопаузального возраста, с дольковым или высокодифференцированным протоковым раком. Клетки, как правило, расположены в виде комплексов, наблюдается укрупнение размеров клеток и ядерный хроматин грубый, имеются ядрышки. Вместе с тем клетки располагаются примерно на одинаковом расстоянии и ориентированы в одном направлении, контуры ядер ровные, хроматин распределен равномерно (рис. 3).

Рис. 3. Рутинная цитограмма фиброаденомы молочной железы. Окр. по Паппенгейму. Ув. ×400.

Методом АСМ при фиброаденоме в клетках эпителия хорошо видна сглаженность микрорельефа ядер (рис. 4). Контуры ядра, цитоплазмы ровные. Если провести сечение клеток вдоль оси Z, определяются высота ядра – 417±89 нм и цитоплазмы – 239±57 нм. Соотношение высоты ядра и цитоплазмы 1.8±0.4. Этот параметр может служить объективным критерием дифференциальной диагностики ФА и рака молочной железы (при раке – 3.2±1, при ФА – 1.8±0.4).

Рис. 4. АСМ изображение фиброаденомы молочной железы.

Клинический пример

Больная М., 42 года. В анамнезе рак молочной железы справа шесть лет назад, в настоящее время узловое образование в левой молочной железы. По данным УЗИ – фиброаденома, по данным маммографии – подозрение на наличие рака. При цитологическом исследовании методами световой микроскопии материала тонкоигольной аспирационной биопсии, взятого из узлового образования МЖ, оказалось невозможным исключить высокодифференцированный дольковый РМЖ на фоне фиброаденомы. Материал был подвергнут изучению средствами АСМ, и оказалось, что, наряду с отсутствием ядрышек, среднее отношение высоты ядра к высоте цитоплазмы равно 1,7 (при максимальном по всем препаратам данной пациентки значении 2,5) (рис. 5). Согласно приведенной таблице 1 был поставлен диагноз ФА, что было подтверждено последующим гистологическим исследованием.

Рис. 5. АСМ изображение фиброаденомы молочной железы больной М.
Изображение клетки эпителия молочной железы.

Таблица 1. Параметры клеток рака и нормальных клеток, полученные методом АСМ.

Исследуемые клетки	Высота цитоплазмы над подложкой, нм	Высота ядра над подложкой, нм	Соотношение высоты ядра и цитоплазмы	Высота ядрышка над подложкой, нм	Отношение высоты ядрышка над ядром к высоте ядра над подложкой
Клетки рака молочной железы	248±94	742±143	3.2±1	880±194	0.28±0.14
Клетки фиброаденомы	239±94	417±89	1.8±0.4	–	–

Вторая задача – объективизация определения степени дифференцировки рака МЖ. Средние значения отношений высот ядер к высоте цитоплазмы для рака молочной железы различных степеней дифференцировки при обычной окраске препаратов приведены в таблице 2.

Таблица 2. Средние значения отношений высот ядер к высоте цитоплазмы для рака молочной железы при различных степенях дифференцировки.

Степень дифференцировки рака молочной железы	Низкая	Умеренная	Высокая	Фиброаденома
Среднее отношение высоты ядра к высоте цитоплазмы	3,2	3,7	2,9	2,5

Важным показателем степени дифференцировки рака молочной железы может служить структура и размеры ядрышек. При фиброаденоме ядрышки отсутствовали. В наших исследованиях мы наблюдали 3 вида ядрышек: при высокодифференцированном раке преобладали цилиндрической формы ядрышки диаметром в среднем 0,6 мкм с толщиной стенок около 200 нм и высотой над ядром порядка 20 нм; при умеренно-дифференцированном – цилиндрические с диаметром около 3 мкм, толщиной стенок порядка 1 мкм и высотой над ядром порядка 50 нм; при низкодифференцированном – в виде сплошного (нецилиндрического) возвышения диаметром 2 мкм и высотой над ядром около 150 нм (рис. 6, 7, 8, 9).

Рис. 6. АСМ изображение клеток умеренно-дифференцированного протокового РМЖ.

Рис. 7. Сечение вдоль оси Z ядрышка цилиндрической формы
при умеренно-дифференцированном протоковом раке МЖ.

Рис. 8. АСМ изображение клеток низкодифференцированного протокового РМЖ.

Рис. 9. Сечение вдоль оси Z сплошного плотного ядрышка
при низкодифференцированном протоковом раке.

Таким образом, были получены дифференциально-диагностические критерии между различными степенями дифференцировки рака МЖ – по соотношению высот ядра и цитоплазмы и по форме ядрышек и размеру ядрышек.

Третья задача – объективизация иммуноцитохимической реакции (ИЦХ) гиперэкспрессии онкопротеина Неr2/neu, выражающейся в интенсивном окрашивании цитоплазматической мембраны опухолевых клеток, что отражает образование комплекса антиген-антитело. Важность определения при раке молочной железы гиперэкспрессии рецептора эпидермального фактора роста 2-го типа Неr2/neu, придающего клеткам свойство неограниченного деления, определяется тем, что эти опухоли, с одной стороны, имеют плохой прогноз, но в то же время эти опухоли хорошо поддаются таргетной терапии герцептином. АСМ иммуноцитохимических препаратов с гиперэкспрессией Неr2/neu демонстрирует четкое увеличение и уплотнение мембраны опухолевых клеток. При этом возможна оценка интенсивности иммуноцитохимической реакции по высоте окрашенной мембраны. Легко оценивать и замкнутость окраски мембраны. При АСМ гиперэкспрессия Неr2/neu проявляется возвышением мембраны клеток на 850 нм (рис. 10, 11, 12).

Рис. 10. Гиперэкспрессия Неr2/neu при раке молочной железы. ИЦХ. Ув. ×400.

Рис. 11. АСМ изображение выраженной экспрессии Her2/neu после ИЦХ.
Отмечена стрелкой гиперэкспрессия Her2/neu, характеризующаяся утолщением цитоплазмы.

Рис. 12. АСМ изображение выраженной экспрессии Her2/neu. Сечение вдоль оси Z.
Отмечена стрелкой гиперэкспрессия Her2/neu, характеризующаяся утолщением цитоплазмы.

Выводы

Новый метод АСМ позволяет определить объективные дифференциально-диагностические критерии между фиброаденомой и инвазивным протоковым раком. На модели рака молочной железы обнаружена разница в соотношениях высоты ядра и цитоплазмы. Для клеток рака характерно увеличение соотношения высоты ядра и цитоплазмы; по-видимому, это связано с нарушением структуры мембран при злокачественной трансформации клеток.

Получены объективные критерии определения степени дифференцировки рака МЖ. Средние значения отношений высот ядер к высоте цитоплазмы для рака молочной железы различных степеней дифференцировки различны и увеличиваются по мере нарастания степени злокачественности. Важным показателем степени дифференцировки рака молочной железы могут служить структура и размеры ядрышек.

АСМ позволяет дополнительно оценивать результаты иммуноцитохимической реакции. В нашем исследовании гиперэкспрессия Her2/neu при АСМ проявлялась в виде четкого замкнутого возвышения цитоплазмы.

Литература

1. Гущина Ю.Ю., Олюнина Л.Н., Гончарова А.П., Веселов А.П., Мацкова Ю.А., Ежевская М.А. Исследование поверхности клеток Azotobacter Chroococcum в условиях гипертермии методом Атомно-Силовой Микроскопии. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования. 2005 5: 87-92.
2. Гущина Ю.Ю., Плескова С.Н., Звонкова М.Б. Исследование различий морфологических параметров клеток крови человека методом Сканирующей Зондовой Микроскопии. Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования. 2005; 1: 48-53.
3. Кирпичников М.П. Молекулярная диагностика детских инфекций методом атомно-силовой микроскопии. В мире науки. 2006; 9: 82-85.
4. Миронов В.Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии М.: Техносфера, 2004.
5. Саликова С.П., Стадников А.А., Никиян А.Р. Атомно-силовая микроскопия – новая возможность в изучении кардиомиоцитов. Вестник ОГУ, 2003; 1: 56-62.
6. Чиссов В.И., Волченко Н.Н., Решетов И.В., Сухарев С.С., Славнова Е.Н., Иванов Ю.С., Багров Д.В. Атомно-силовая микроскопия как метод уточняющей диагностики в онкоцитологии. Тезисы докладов Всероссийской научной конференции с международным участием «Нанотехнологии в онкологии. М., 2008; 80-81.
7. Яковлева В.А., Лисицин Ф.В., Маныкин А.А., Конышева Т.А. Опыт применения Атомно-Силовой микроскопии при исследовании цитологических препаратов у женщин с папилломовирусными поражениями и опухолями гениталий. Новости клинической цитологии России. Москва, 2007; 1-2: 35-37.
8. Chernoff D.A. Atomic Force/Scanning Probe Microscopy of Pharmaceutical and Biological Materials. Nanotech 2008. Technical Proceedings of the 2008 Nanotechnology Conference and Trade Show. Vol.2.
9. Lal R., John D.W., Laird S.A., Arnsdorf M.F. Heart gap preparation reveal hemiplagues by atomic force microscopy. Am. J. Physiol. Society. 1995; 68: 967-77.
10. Máire A., Duggan M.D. Cytologic and Histologic Diagnosis and Significance of Controversial Squamous Lesions of the Uterine Cervix. Mod. Pathol. 2000; 13(3): 252-260.
11. Murphy M.F., Lalor M.J., Manning F.C.R., Lilley F., Crosby S.R., Randall C., Burton D.R. Comparative study of the conditions required to image live human epithelial and fibroblast cells using atomic force microscopy. Microsc. Res. Tech. 2006; Aug 4: 16892195 (P, S, G, E, B).
12. Sanjeev G. Shroff, Donald R. Saner et al. Dynamic micromechanical properties of cutured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy. Am. J. Physiol. Society. 1995; 269: (Cell Physiol, 38): 286-329.