Перспективы молекулярно-генетического мониторинга колоректального рака и некоторых других видов злокачественных новообразований человека
Зарецкий А.Р.1,2*, Белоусова А.В.2, Дрозд О.В.2, Шагин Д.А.1,2
1 ИБХ им. акад. М. М, Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН,
2 ООО «Евроген Лаб», Москва, Россия
Приложение «Нанотехнологии в онкологии» к журналу «Онкохирургия» за 2012 год. Том 4, №1
Введение. Фрагменты ДНК опухолевого происхождения могут быть обнаружены в различных биологических образцах онкологических больных, включая плазму крови, мочу, слюну и даже конденсат выдыхаемого воздуха. Качественный и количественный анализ опухолеспецифических ДНК может стать основой для минимально инвазивного скрининга злокачественных опухолей, оценки радикальности проведенного лечения, а также для мониторинга динамики опухолевого процесса и изменения профиля лекарственной чувствительности опухолевых клеток в ходе терапии. Однако мутантные и гиперметилированные фрагменты ДНК опухолевого происхождения представлены в этих образцах, во-первых, в предельно малом количестве, а во-вторых, на фоне многократно большего количества фрагментов ДНК «дикого типа», попадающих туда из неизмененных органов. Соответственно, основой для неинвазивной генодиагностики рака могут стать только методы с высокой чувствительностью и избирательностью.
Цель. Разработать стратегию создания тест-систем для неинвазивной генодиагностики в онкологии.
Материалы и методы. Были систематизированы данные научной литературы об имеющихся технологиях мутационно-специфического анализа и уровне их чувствительности, специфичности и воспроизводимости. На основе систематизированных данных выбирались наиболее перспективные технологии, в которые далее вносились необходимые модификации и дополнения. Тестирование вариантов технологии осуществлялось с помощью ПЦР в режиме реального времени, результаты которой проверялись анализом кривой плавления, электрофорезом в ПААГ и секвенированием продуктов ПЦР. Использовались панели валидированных контрольных образцов ДНК.
Результаты. По результатам анализа литературных данных наиболее перспективными методами были признаны т. н. «proof-reading PCR» и «wild-type blocking PCR». Применимыми для неинвазивной генодиагностики рака могут быть методы с избирательностью ≥ 1 : 100; однако для осуществления таких задач, как скрининг, необходима избирательность порядка 1 : 100 000. Разработанные нами тест-системы для анализа мутаций в генах K-Ras и B-Raf , использующие метод «wild-type blocking PCR», обеспечивают избирательность порядка 1 : 200 при использовании ПЦР в режиме реального времени и порядка 1 : 2 000 при использовании ПЦР с последующим прямым секвенированием продуктов ПЦР по Сэнгеру. Чувствительность данных методик в обоих случаях составляет около 10 копий в реакции. Методики отличаются также хорошей воспроизводимостью на ДНК из различных биологических образцов.
Заключение и выводы. Разработанные нами тест-системы позволяют решать некоторые задачи ненинвазивной генодиагностики в онкологии. Для получения более универсальных тест-систем необходимо значительное увеличение избирательности анализа. Вопреки мнению ряда авторов, мы полагаем, что добиться такого увеличения путем модификации условий реакции почти невозможно. В докладе будут описаны подходы к практически неограниченному увеличению избирательности мутационного анализа с применением высокопроизводительных генетических анализаторов, а также будут сформулированы требования к биологическому материалу для такого высокоизбирательного анализа и методологические предосторожности, необходимые при интерпретации его результатов.