Молекулярно-генетические исследования при выборе тактики хирургического и химиотерапевтического лечения рака щитовидной железы

Решетов И.В.³, Голубцов А.К.³, Абрамов А.А.^1,2, Белохвостов А.С.^1,2, Горюнков А.Г.⁴, Крехно О.П.³

1) Научно-практический центр медицинской помощи детям Департамента здравоохранения,
2) Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии,
3) Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена,
4) Институт повышения квалификации ФМБА, Москва, России

---

Введение

Последние исследования молекулярно-генетических механизмов в опухолевых клетках открыли новые широкие горизонты для их практического применения в этой области. Генетика и онкология взаимодействуют все тесней. Становятся понятны многие генетические пути образования раковых клеток.

Генетические изменения определяют злокачественность опухолевых клеток, возможности васкуляризации, метастазирования и инфильтрации. Все большее место в лечение опухолевых заболеваний занимает таргетная терапия, когда при лечении онкологического заболевания выбирают конкретные мишени (например, рецепторы, ответственные за активацию клетки). В этом случае необходимо знать генетическое состояние мишени, так как действие препарата в случае наличия мутации в данной области может быть другим.

Рак щитовидной железы (РЩЖ) является наиболее распространенным онкологическим заболеванием эндокринной системы. Заболеваемость им неуклонно растет. Чаще всего РЩЖ возникает из клеток щитовидной железы фолликулярного типа и включает хорошо дифференцированную папиллярную (ПКЩ) и фолликулярную карциномы (ФКЩ), а также слабо дифференцированную и анапластическую карциномы.

Папиллярный рак является наиболее распространенным видом РЩЖ (около 80%), затем следуют фолликулярные карциномы (около 15%). Медуллярный рак щитовидной железы (МРЩ) ассоциирован с парафолликулярной щитовидной железой, составляя около 3% от РЩЖ.

Мутации генов при раке щитовидной железы

При РЩЖ обнаруживаются мутации нескольких генов (Табл. 1) [1]. Для папиллярного рака характерны мутации генов BRAF и RAS, а также RET/PTC и TRK перестройки, которые способны запускать митоген-активированный протеинкиназный путь (МАРК). Эти взаимоисключающие мутации встречаются более чем в 70% папиллярных карцином щитовидной железы [2-5].

Фолликулярная карцинома, как известно, содержит мутации RAS-каскада или PAX8/PPARγ перестановки. Эти мутации также взаимно исключают друг друга, и при фолликулярной карциноме обнаруживаются в 70-75% [6]. Генетические изменения, связанные с PI3K/AKT-сигнальным путем, встречаются и в опухолях щитовидной железы, хотя они редки при хорошо дифференцированном раке щитовидной железы и имеют более высокую распространенность при менее дифференцированной карциноме щитовидной железы [7-9].

Другие мутаций связаны с TP53 и CTNNB1 генами [10]. В медуллярной карциноме щитовидной железы обнаруживают как наследственные, так и спорадические точечные мутации, расположенные в RET гене [11].

Таблица 1

Распространенность мутаций при разных типах рака щитовидной железы [1]

Тип опухоли	Частота встречаемости мутаций, %
Папиллярная карцинома	40-45
BRAF	10-20
RET/PTC	10-20
RAS	<5
TKR
Фолликулярная карцинома
RAS	40-50
PAX8-PPARγ	30-35
PIK3CA	<10
PTEN	<10
Слабо дифференцированная карцинома
RAS	25-30
Β-Catenin (CTNNB1)	10-20
TP53	20-30
BRAF	10-15
Анапластическая карцинома
TP53	70-80
Β-Catenin (CTNNB1)	60-70
RAS	40-50
BRAF	20-30
Медуллярная карцинома
Наследственные мутации RET	>95
Спорадические мутации RET	40-50

BRAF мутации

Самыми распространёнными (особенно при папиллярном раке) и представляющими существенный интерес как диагностический и прогностический маркер являются мутации гена BRAF. BRAF − серин-треониновой киназа семейства RAF-белков, которые являются внутриклеточными эффекторами каскада МАРК сигнализации. Их активация вызывается RAS-опосредованными белками клеточной мембраны. В результате происходит фосфорилирование и активация ниже по каскаду МАРК.

Точечные мутации гена BRAF являются наиболее распространенными генетическими изменениями, наблюдающимися при папиллярном раке щитовидной железы (в 40-45%) [12, 13]. Преимущественно это точечные мутации, которые связаны с нуклеотидом 1799 и приводят к замене валина на глутамат в кодоне 600 (V600E) [14-15].

Следствием этого является неограниченная активация BRAF-киназы и хроническая стимуляция пути МАРК [16-17]. В 1-2% папиллярного рака обнаруживаются другие мутации BRAF, в т. ч. K601E точечная мутация и смещение в рамке считывания за счет вставки или удаления в кодон 600 [18-22], а также AKAP9/BRAF перестановки, которые чаще встречаются при папиллярном раке, связанном с радиоактивным облучением. BRAF V600E мутации, как правило, можно найти при папиллярном раке с классическим вариантом гистологии.

Они редко встречаются в фолликулярном варианте папиллярной карциномы. В дополнение к папиллярной карциноме, BRAF V600E мутации также обнаруживаются в слабо дифференцированных карциномах и анапластических карциномах щитовидной железы. BRAF V600E не обнаруживается в фолликулярной карциноме и доброкачественных узлах щитовидной железы, являясь весьма специфическим маркером папиллярного рака [14].

Молекулярное тестирование на BRAF V600E щитовидной железы при тонкоигольной аспирации (FNA) образцов значительно улучшает точность цитологической диагностики узлов щитовидной железы. Мета-анализ 18 исследований BRAF в 2766 FNA образцах щитовидной железы показал, что из 581 BRAF-позитивных образцов в 580 были обнаружены папиллярные карциномы. Только 1 BRAF-положительный образец относился к «атипичной узловой гиперплазии» [21].

Таким образом, частота злокачественных опухолей в BRAF-положительных образцах составляла 99,8%. Важно отметить, что от 15 до 39% BRAF-позитивных образцов цитологически оказываются неопределенными, из чего следует, что тестирование на BRAF может помочь в установлении окончательного диагноза рака в узелках с неясной цитологией [24-29] (Рис. 1).

Рис. 1. Ассоциация между BRAF V600E и степенью опухолевой инфильтрации:
А – полностью инкапсулированные опухоли; B – неинкапсулированные без инфильтрации капсулы;
С – инфильтрация капсулы щитовидной железы; D – экстратиреоидальные расширение [28].

Еще более важно, что мутация BRAF V600E может быть независимым предиктором неудачного лечения и рецидива опухоли даже у пациентов на ранней стадии заболевания, а также независимым фактором риска для опухолей, связанных со смертью. Прогностическая ценность мутации BRAF имеет особое значение в стадии T1 папиллярного рака, представленными опухолями размерами 2 см или менее [22].

Более агрессивное поведение BRAF V600E-позитивных опухолей может быть связано с их склонностью к дедифференцировке, а также с тем, что эта мутация приводит к изменениям функции канала йодида натрия и метаболизма йодида, уменьшая тем самым способность опухоли улавливать радиоактивный йод (Рис. 2).

Рис. 2. Корреляция выживаемости с мутацией BRAF V600E [29]

Наиболее часто встречающаяся проблема, связанная с принятием хирургических решений для РЩЖ, − предоперационная неопределенность в отношении конкретного пациента. Объемные хирургические вмешательства, как правило, связаны со значительным снижением рецидивов и смертности, но несут повышенный риск хирургических осложнений, таких, как травмы возвратного гортанного нерва и паращитовидных желез.

Рецидив ПКЩ встречается чаще всего в лимфатических узлах шеи, особенно в ее центральном отсеке. Часто решить проблему, кто нуждается в диссекции лимфатических узлов, особенно профилактически, достаточно сложно. Учитывая уникальные прогностические возможности, анализ BRAF мутаций может быть использован для минимизации рисков, тем более что он может быть проведен до операции.

Действительно, недавние исследование показали, что BRAF мутации, выявленные до операции в FNA образцах, предсказали такую патологическую агрессивность ПКЩ, как экстратиреоидальное разрастание, метастазирование в лимфатические узлы и рецидив. Таким образом, использование мутаций BRAF может быть новым и полезным прогностическим маркером для выбора стратегии при оценке риска хирургического лечения ПКЩ.

Учитывая ухудшение восприятия радиоактивного йода ПКЩ с BRAF мутациями, следует рассматривать использование относительно высоких доз радиоактивного йода (от 75 мКи или выше). При отсутствии мутации в гене BRAF принятие решения о лечении радиоактивным йодом должно основываться на оценке обычных факторов риска.

После хирургического лечения у пациентов с мутацией в гене BRAF необходимо проводить ежегодный мониторинг данного маркера, для чего можно использовать плазму периферической крови и слюну. Обнаружение мутаций в этих образцах позволяет принимать превентивные меры, направленные на предотвращение возникновения рецидива.

При анализе опухолевого материала или биоптата мы получаем доступ непосредственно к клеткам, потенциально содержащим мутацию в гене BRAF. Следует, однако, учитывать, что при анализе опухолевой ткани в образец может попасть определенный процент нормальных клеток, не содержащих генную мутацию, поэтому существенным подспорьем для исследователя является морфологический анализ препарата опухоли с заключением о содержании опухолевых клеток.

Перспективным для диагностики и мониторинга заболевания является исследование ДНК, полученной из плазмы периферической крови и из слюны, позволяющее оценить присутствие опухолевых маркеров на ранних стадиях и обеспечить мониторинг успешности лечения, однако требующее использованием таких высокочувствительных методик, как цифровая ПЦР или ПЦР в реальном времени с ингибированием нормальных ДНК-фрагментов.

RAS мутации

Семейство RAS генов человека включает HRAS, KRAS и NRAS гены. Они кодируют G-белки, которые расположены на внутренней поверхности клеточной мембраны и распространяют сигналы, связанные с рецептором тирозинкиназы и G-белками по МАРК, PI3K/AKT и другим сигнальным путям. Активация точечных мутаций в дискретных областях генов RAS (кодоны 12/13 и 61) часто встречается в различных типах опухолей человека.

В большинстве типов рака преобладают мутации в 12/13 кодоне KRAS, в опухоли щитовидной железы наиболее часто встречаются мутации NRAS кодона 61 и HRAS кодона 61. RAS мутации встречаются с переменной частотой во всех типах фолликулярных клеток щитовидной железы опухолевого происхождения. При папиллярном раке щитовидной железы RAS мутации обнаруживаются в 10−20% опухолей [30−35], фолликулярной карциноме обычного типа − в 40−50% [33, 36−40], фолликулярной аденоме обычного типа – в 20−40% [28, 37−40].

Обнаружены RAS мутации в гиперпластических узелках. Мутации RAS в карциномах щитовидной железы коррелируют с опухолевой дифференцировкой и менее благоприятным прогнозом. Найдена значимая корреляция между RAS мутациями и метастатическим поведением фолликулярной и папиллярной карцином, особенно в отношении костных метастазов. С другой стороны, RAS мутации часто встречаются в герметичном варианте фолликулярно-папиллярного рака.

Обнаружение RAS мутации в щитовидной железе дает убедительные доказательства неоплазии, хотя не устанавливает степень злокачественности. Важность обнаружения мутации RAS состоит в том, что она является маркером фолликулярного варианта папиллярного рака, который наиболее трудно диагностируется FNA цитологией. RAS мутации − наиболее распространенный тип мутаций, обнаруженный в образцах FNA из узлов щитовидной железы [26, 27].

В нескольких проспективных исследованиях RAS мутации были обнаружены в 74−88% образцах, демонстрируя положительную прогностическую ценность. Некоторые RAS-положительные узелки были диагностированы как доброкачественные фолликулярные аденомы, что формально является ложно-положительным результатом.

Тем не менее, можно предположить, что RAS-позитивные фолликулярные аденомы являются предшественником RAS-положительной фолликулярной карциномы и, возможно, фолликулярного варианта папиллярного рака. Следовательно, при обнаружении мутации в генах RAS для предотвращения предполагаемой прогрессии может быть оправданным хирургическое удаление фолликулярной аденомы.

Мутации гена RET

Соматические мутации гена RET, которые присутствуют примерно в 40−50% медуллярного рака щитовидной железы (МРЩ), могут представлять плохой прогностический фактор для исхода у больных МРЩ.

Большинство мутаций RET (около 79%) обнаруживаются в кодоне 918 экзона 16 [43-45]. Основные мутации − замена метионина (ATG) на треонин (ACG). Мутации также обнаруживаются в 10, 11 и 15 экзонах и не обнаруживаются в экзонах 13 и 14 (рис. 3) [43-45]. Соматические мутации RET значительно чаще встречаются в более крупных опухолях с узловыми и удаленными метастазами, однако корреляция между RET мутациями и количеством метастазов в лимфатических узлах отсутствует. Соматические мутации RET также связаны с более продвинутой стадией на момент постановки диагноза.

Рис. 3. Распространенность соматических мутаций RET при МРЩ [45].

МРЩ является агрессивным раком щитовидной железы, прогноз которого во многом определяется стадией на момент постановки диагноза. Поэтому ранняя диагностика может значительно улучшить результат лечения таких пациентов. Наличие соматической мутации в RET МРЩ опухолевой ткани представляет плохой прогностический фактор для исхода болезни.

Больные МРЩ с соматической мутацией RET не только имеют большую вероятность неудачного лечения, но и больший риск смерти, о чем свидетельствуют их значительно худшая 30-летняя выживаемость по сравнению с пациентами без мутации RET (Рис. 4).

Рис. 4. Кривые выживаемости пациентов МРЩ с и без RET соматических мутаций [45].

Наличие метастатических узлов на момент постановки диагноза является известным отрицательным прогностическим фактором для полного излечения. Статистически значимая корреляция между мутациями RET и метастазами в лимфатических узлах ставит вопрос о возможности проведения модифицированной радикальной диссекции шеи с удалением узлов в ипсилатеральных или двусторонних отсеках.

Идентификация RET мутаций в ДНК, извлеченной из FNAB, может служить маркером распределения пациентов с высоким (RET положительный) и низким (RET отрицательный) риском метастазирования в лимфатические узлы и определять необходимость радикальной диссекции шеи [42, 43].

Развитие таргетной терапии повышает ценность обнаружения мутаций гена RET в опухоли. В RET-положительных случаях могут быть использованы ингибиторы тирозинкиназы, имеющие высокое сродство к RET. Однако для выявления пациентов, которые будут реагировать на RET-таргетную терапию, необходимо решить проблему доступности генетического теста.

Целью нашего исследования являлся анализ мутаций в генах BRAF и KRAS, а также мутаций в 5-8 экзонах гена р53 в различных биологических образцах больных раком щитовидной железы для оценки возможности проведения молекулярно-генетических тестов, позволяющих получать клинически значимую информацию.

Для этого производили забор биологического материала у пациентов до (10 мл периферической крови и 2 мл слюны) и после операции. Для максимальной сохранности циркулирующих нуклеиновых кислот и предотвращения разрушения ядросодержащих клеток кровь забирали в пробирку с 1 мл ЭДТА-содержащего антикоагулянта. Всего были проанализированы данные 45 больных (папиллярный рак щитовидной железы − 35, фолликулярный − 3, медуллярный – 4, аденома щитовидной железы – 3).

Результаты

При папиллярном раке р53 мутации при анализе плазмы крови обнаружены у 5 больных из 11 в опухолевой ткани (45%), в слюне − у 2 из 6 в опухолевой ткани (33%), BRAF − у 5 в плазме крови из 14 в опухолевой ткани (35%), у 5 в слюне из 10 в опухолевой ткани (50%), KRAS − у 4 из 6 в опухолевой ткани (66%).

Одна из мутаций в исследуемой панели генов при папиллярном раке в образцах операционного материала встречалась у 19 из 27 (70%) пациентов, чаще всего − в 15-м экзоне гена BRAF (51%) и 7-ом экзоне гена p53 (34%). При этом у 3-х больных мутации гена р53 носили наследственный характер.

Во всех наблюдениях фолликулярного рака была обнаружена одна из мутаций, при этом 2 раза встретилась мутация в гене KRAS и один раз − в гене р53. При медуллярном раке в 3-х из 4-х образцов (75%) была обнаружена мутация в гене р53, при этом мутации не встречались ни в гене BRAF, ни в гене KRAS, что соответствует данным литературы.

В нашем исследовании анализировали 3-х пациентов с аденомой (мутаций в исследуемых генах обнаружено не было) и 10 образцов нормальной ткани щитовидной железы, в которых было обнаружено 3 мутации (2 из них − в 7 экзоне р53, по-видимому, наследственные; одна − в гене KRAS, что может быть сигналом к последующему перерождению клеток в злокачественные).

Заключение

Возможности молекулярно-генетического анализа позволяют использовать дифференцировать лечение больных с разными типами рака щитовидной железы. На основе анализа генетических изменений в опухолевых клетках становится возможным снизить риск осложнений при операции, уменьшить количество рецидивов и метастазирования, реализовать индивидуальный подход при химиотерапии и облучении. Новые терапевтические стратегии, основанные на использовании различных молекулярных механизмов, открывают возможности персонализированного таргетного лечения.

Проблема молекулярно-генетических исследований в клинической онкологии находится на начальных стадиях своего развития, и многие закономерности еще предстоит обнаружить. Определенные перспективы прослеживаются при исследовании метилирования промоторов ряда генов, а также при оценке профилей экспрессии микроРНК, однако для основательных выводов и внедрения в практику необходимо проведение дальнейших исследований.

Литература/References

1. Nikiforov YE. Molecular diagnostics of thyroid tumors. Arch Pathol Lab Med .2011; 135: 569-77.
2. Adeniran AJ, Zhu Z, Gandhi M, et al. Correlation between genetic alterations and microscopic features, clinical manifestations, and prognostic characteristics of thyroid papillary carcinomas. Am J Surg Pathol. 2006; 30(2): 216-22.
3. Kimura ET, Nikiforova MN, Zhu Z, Knauf JA, Nikiforov YE, Fagin JA. High prevalence of BRAF mutations in thyroid cancer: genetic evidence for constitutive activation of the RET/PTC-RAS-BRAF signaling pathway in papillary thyroid carcinoma. Cancer Res. 2003; 63(7): 1454-7.
4. Soares P, Trovisco V, Rocha AS, et al. BRAF mutations and RET/PTC rearrangements are alternative events in the etiopathogenesis of PTC. Oncogene. 2003; 22(29): 4578-80.
5. Frattini M, Ferrario C, Bressan P, et al. Alternative mutations of BRAF, RET and NTRK1 are associated with similar but distinct gene expression patterns in papillary thyroid cancer. Oncogene. 2004; 23(44): 7436-40.
6. Nikiforova MN, Lynch RA, Biddinger PW, et al. RAS point mutations and PAX8-PPAR gamma rearrangement in thyroid tumors: evidence for distinct molecular pathways in thyroid follicular carcinoma. J Clin Endocrinol Metab. 2003; 88(5): 2318-26.
7. Garcia-Rostan G, Costa AM, Pereira-Castro I, et al. Mutation of the PIK3CA gene in anaplastic thyroid cancer. Cancer Res. 2005; 65(22): 10199-207.
8. Hou P, Liu D, Shan Y, et al. Genetic alterations and their relationship in the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in thyroid cancer. Clin Cancer Res. 2007; 13(4): 1161-70.
9. Ricarte-Filho JC, Ryder M, Chitale DA, et al. Mutational profile of advanced primary and metastatic radioactive iodine-refractory thyroid cancers reveals distinct pathogenetic roles for BRAF, PIK3CA, and AKT1. Cancer Res. 2009; 69(11): 4885-93.
10. Kondo T, Ezzat S, Asa SL. Pathogenetic mechanisms in thyroid follicularcell neoplasia. Nat Rev Cancer. 2006; 6(4): 292-306.
11. de Groot JW, Links TP, Plukker JT, Lips CJ, Hofstra RM. RET as a diagnostic and therapeutic target in sporadic and hereditary endocrine tumors. Endocr Rev. 2006; 27(5): 535-60.
12. Kimura ET, Nikiforova MN, Zhu Z, Knauf JA, Nikiforov YE, Fagin JA. High prevalence of BRAF mutations in thyroid cancer: genetic evidence for constitutive activation of the RET/PTC-RAS-BRAF signaling pathway in papillary thyroid carcinoma. Cancer Res. 2003; 63(7): 1454-7.
13. Cohen Y, Xing M, Mambo E, et al. BRAF mutation in papillary thyroid carcinoma. J Natl Cancer Inst. 2003; 95(8): 625-7.
14. Xing M. BRAF mutation in thyroid cancer. Endocr Relat Cancer. 2005; 12(2): 245-62.
15. Ciampi R, Nikiforov YE. Alterations of the BRAF gene in thyroid tumors. Endocr Pathol. 2005; 16(3): 163-72.
16. Wan PT, Garnett MJ, Roe SM, et al. Mechanism of activation of the RAFERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF. Cell 2004; 116(6): 855-67.
17. Knauf JA, Ma X, Smith EP, et al. Targeted expression of BRAFV600E in thyroid cells of transgenic mice results in papillary thyroid cancers that undergo dedifferentiation. Cancer Res 2005; 65(10): 4238-45.
18. Trovisco V, Vieira de Castro I, Soares P, et al. BRAF mutations are associated with some histological types of papillary thyroid carcinoma. J Pathol. 2004; 202(2): 247-51.
19. Carta C, Moretti S, Passeri L, et al. Genotyping of an Italian papillary thyroid carcinoma cohort revealed high prevalence of BRAF mutations, absence of RAS mutations and allowed the detection of a new mutation of BRAF oncoprotein (BRAF(V599lns)). Clin Endocrinol (Oxf). 2006; 64(1): 105-9.
20. Hou P, Liu D, Xing M. Functional characterization of the T1799-1801del and A1799-1816ins BRAF mutations in papillary thyroid cancer. Cell Cycle. 2007;6(3):377-379.
21. Chiosea S, Nikiforova M, Zuo H, et al. A novel complex BRAF mutation detected in a solid variant of papillary thyroid carcinoma. Endocr Pathol. 2009; 20(2): 122-6.
22. Basolo F, Torregrossa L, Giannini R, et al. Correlation between the BRAF V600E mutation and tumor invasiveness in papillary thyroid carcinomas smaller than 20 millimeters: analysis of 1060 cases. J Clin Endocrinol Metab. 2010; 95(9): 4197-205.
23. Nikiforova MN, Nikiforov YE. Molecular diagnostics and predictors in thyroid cancer. Thyroid. 2009; 19(12): 1351-61.
24. Nikiforov YE, Steward DL, Robinson-Smith TM, et al. Molecular testing for mutations in improving the fine-needle aspiration diagnosis of thyroid nodules. J Clin Endocrinol Metab. 2009; 94(6): 2092-8.
25. Pizzolanti G, Russo L, Richiusa P, et al. Fine-needle aspiration molecular analysis for the diagnosis of papillary thyroid carcinoma through BRAF V600E mutation and RET/PTC rearrangement. Thyroid. 2007; 17(11): 1109-15.
26. Jo YS, Huang S, Kim YJ, et al. Diagnostic value of pyrosequencing for the BRAF V600E mutation in ultrasound-guided fine-needle aspiration biopsy samples of thyroid incidentalomas. Clin Endocrinol (Oxf). 2009; 70(1): 139-44.
27. Cohen Y, Rosenbaum E, Clark DP, et al. Mutational analysis of BRAF in fine needle aspiration biopsies of the thyroid: A potential application for the preoperative assessment of thyroid nodules. Clin Cancer Res. 2004;10:2761-2765.
28. Basolo F, Torregrossa L, at al. Correlation between the BRAF V600E Mutation and Tumor Invasiveness in Papillary Thyroid Carcinomas Smaller than 20 Millimeters: Analysis of 1060 Cases Biostatistics Research Unit (M.M., A.B.), and Endocrinology (R.E., P.V.), University of Pisa, 56126 Pisa, Italy.
29. Prognostic Utility of BRAF Mutation in Papillary Thyroid Cancer Mingzhao Xing Mol Cell Endocrinol. Author manuscript; available in PMC. 2011 May 28.
30. Namba H, Rubin SA, Fagin JA. Point mutations of ras oncogenes are an early event in thyroid tumorigenesis. Mol Endocrinol 1990; 4(10): 1474-9.
31. Karga H, Lee JK, Vickery AL Jr, Thor A, Gaz RD, Jameson JL. Ras oncogene mutations in benign and malignant thyroid neoplasms. J Clin Endocrinol Metab. 1991; 3(4): 832-6.
32. Hara H, Fulton N, Yashiro T, Ito K, DeGroot LJ, Kaplan EL. N-ras mutation: an independent prognostic factor for aggressiveness of papillary thyroid carcinoma. Surgery. 1994; 116(6): 1010-6.
33. Basolo F, Pisaturo F, Pollina LE, et al. N-ras mutation in poorly differentiated thyroid carcinomas: correlation with bone metastases and inverse correlation to thyroglobulin expression. Thyroid. 2000; 10(1): 19-23.
34. Ezzat S, Zheng L, Kolenda J, Safarian A, Freeman JL, Asa SL. Prevalence of activating ras mutations in morphologically characterized thyroid nodules. Thyroid. 1996; 6(5): 409-16.
35. Vasko VV, Gaudart J, Allasia C, et al. Thyroid follicular adenomas may display features of follicular carcinoma and follicular variant of papillary carcinoma. Eur J Endocrinol. 2004; 151(6): 779-86.
36. Zhu Z, Gandhi M, Nikiforova MN, Fischer AH, Nikiforov YE. Molecular profile and clinical-pathologic features of the follicular variant of papillary thyroid carcinoma: an unusually high prevalence of ras mutations. Am J Clin Pathol. 2003; 120(1): 71-7.
37. Lemoine NR, Mayall ES, Wyllie FS, et al. High frequency of ras oncogene activation in all stages of human thyroid tumorigenesis. Oncogene. 1989; 4(2): 159-64.
38. Suarez HG, du Villard JA, Severino M, et al. Presence of mutations in all three ras genes in human thyroid tumors. Oncogene. 1990; 5(4): 565-70.
39. Esapa CT, Johnson SJ, Kendall-Taylor P, Lennard TW, Harris PE. Prevalence of ras mutations in thyroid neoplasia. Clin Endocrinol (Oxf). 1999; 50(4): 529-35.
40. Motoi N, Sakamoto A, Yamochi T, Horiuchi H, Motoi T, Machinami R. Role of ras mutation in the progression of thyroid carcinoma of follicular epithelial origin. Pathol Res Pract. 2000; 196(1): 1-7.
41. Lemoine NR, Mayall ES, Wyllie FS, et al. Activated ras oncogenes in human thyroid cancers. Cancer Res. 1988; 48(16): 4459-63. Int J Mol Sci 2012; 13: 221-39. doi: 10.3390/ijms13010221.
42. Ceolin L, Siqueira DR, et al. Molecular basis of medullary thyroid carcinoma: The role of RET polymorphisms. Int J Molecular Sciences, ISSN 1422-0067. Int J Mol Sci 2012, 13:221-239.
43. Salehian B, Samoa R. RET Gene Abnormalities and Thyroid Disease: Who Should be Screened and When City of Hope Department of Diabetes, Endocrine & Metabolism, California, USA. J Clin Res Pediatr Endocrinol. 2013; 5 Suppl 1:70-8.
44. Elisei R, Cosci B, et al. Prognostic Significance of Somatic RET Oncogene Mutations in Sporadic Medullary Thyroid Cancer: A 10-Year Follow-Up Study 2008 Mar: 93(3): 682-7.
45. Romei C, Ugolini C, et al. Low prevalence of the somatic M918T RET mutation in micro-medullary thyroid cancer. Thyroid. 2012 May; 22(5) :476-81.