Galectin-3 и HBME-1 в дооперационной диагностике высокодифференцированного рака щитовидной железы

М.Е. Борискова¹, Д.Ю. Семёнов¹, Л.Е. Колоскова², У.В. Фарафонова¹

1) Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова, кафедра общей хирургии с клиникой,
2) ООО «Медицинские лаборатории», Санкт-Петербург, Россия

---

Рак щитовидной железы является наиболее распространенным онкологическим заболеванием эндокринной системы человека и составляет 1-3% в общей структуре заболеваемости злокачественными образованиями. Показательны статистические данные по Санкт-Петербургу: в период между 2000 и 2011 гг. показатели заболеваемости раком ЩЖ возросли от 2,2 до 7,6 случаев на 100000 населения [1]

Современным стандартом дифференциальной диагностики узловых образований щитовидной железы является тонкоигольная аспирационная биопсия (ТАБ) под контролем УЗИ. Однако данный метод имеет ряд ограничений, а именно получение неопределенных результатов (фолликулярная или гюртлеклеточная опухоль), которые составляют до 30% от всех цитологических заключений [2]. Отсутствие точных диагностических критериев дифференциальной диагностики доброкачественной и злокачественной природы узлового образования диктует необходимость выполнения оперативного вмешательства с диагностической целью. По результатам планового гистологического исследования лишь в 15-20% всех фолликулярных опухолей обнаруживают злокачественных процесс, в остальных же случаях операция носит только диагностический характер. Выполнение оперативного вмешательства сопряжено с риском осложнений, как стандартных, так и специфических, таких как гипопаратиреоз и повреждение возвратного гортанного нерва.

Современные достижения в молекулярной биологии злокачественных новообразований, в т.ч. и щитовидной железы, открывают дополнительные возможности для дифференциальной диагностики природы опухоли на дооперационном этапе.

В современной литературе существует множество исследований, посвященных поиску онкомаркеров рака щитовидной железы. Проанализировав исследования последних лет, можно говорить о том, что galectin-3 и HBME-1 являются наиболее перспективными для исследования [3, 4].

Галектин-3 – белок из семейства лектинов, который является маркером развития неопластических процессов. Этот белок принимает участие в межклеточных, клеточно-матриксных взаимоотношениях, играет роль в опухолевой прогрессии и апоптозе. Наиболее часто выявляется при фолликулярном раке щитовидной железы [5].

HectorBattiforamesothelialcell-1 (HBME-1) представляет собой моноклональные антитела, направленные против поверхностного белка мезотелиальных клеток. Считается, что HBME-1 – наиболее надежный маркер папиллярного рака щитовидной железы [6]. В случаях фолликулярного рака процент случаев экспрессии HBME-1 не превышает 20-40% по исследованиям ряда авторов.

Таким образом, проточное флюороцитометрическое исследование биомаркеров рака щитовидной железы является многообещающим решением проблемы дифференциальной диагностики фолликулярной опухоли щитовидной железы на дооперационном этапе.

Целью нашей работы явилось исследование панели онкомаркеров, состоящей из GAL-3 и HBME-1, для дифференциальной диагностики фолликулярных опухолей на дооперационном этапе.

Материалы и методы

В исследование вошли 85 пациентов, прооперированных в клинике общей хирургии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова в период с 2009 по 2013 гг. Соотношение мужчин и женщин 1/6, средний возраст 50,1±15,2 лет.

Все пациенты были обследованы по стандартному алгоритму: клинические и лабораторно-инструментальные методы включали определение уровня тиреотропного гормона, УЗИ и ТАБ под контролем УЗИ. Всем пациентам была проведена тонкоигольная аспирационная биопсия под контролем УЗИ, по результатам которого проводилось цитологическое исследование, а содержимое пункционной иглы использовалось для выполнения проточной цитометрии.

На основании данных цитологического исследования пунктата из образований ЩЖ были выделены 3 группы: 1 группу составили 40 пациентов, у которых при цитологическом исследовании были выявлены признаки папиллярного рака. Во 2 группу вошли 40 больных, у которых цитологическое заключение носило неопределенный характер, т.е. невозможно было подтвердить или исключить наличие рака ЩЖ на дооперационном этапе. В 3 группу были объединены 5 пациентов, у которых по результатам цитологического исследования имелись доброкачественные образования, включающие коллоидные узлы ЩЖ (таблица 1).

Таблица 1. Общая характеристика исследуемых групп пациентов.

Характеристика	I	II	III
Заключение ТАБ	Папиллярный рак	Фолликулярная опухоль	Коллоидный узел
Количество пациентов	40	40	5
Соотношение мужчины/женщины	1:8,7	1:6,8	1:2
Средний возраст пациентов	44,3	47,9	54,3

Все пациенты были оперированы. Показаниями к операции были: в 1-й группе – признаки злокачественного роста, во 2-й группе – невозможность исключить РЩЖ по данным ТАБ, в 3-й группе – наличие узла большого размера, вызывающего компрессионный синдром органов шеи. Окончательный диагноз у оперированных пациентов ставили на основании планового гистологического исследования.

Все пациенты были оперированы. Показаниями к операции были в 1-й группе – признаки злокачественного роста, во 2-й группе – невозможность исключить РЩЖ по данным ТАБ, в 3-й группе – наличие узла большого размера, вызывающего компрессионный синдром органов шеи. Окончательный диагноз у оперированных пациентов ставили на основании планового гистологического исследования.

Помимо цитологического исследования, всем пациентам было выполнено определение экспрессии галектина-3 и HBME-1 методом проточной цитофлюорометрии. Забор материала для исследования осуществлялся на дооперационном этапе методом ТАБ под контролем УЗИ. Эффективным считалось выполнение не менее двух пункций из различных областей одного узлового образования. Полученные образцы помещали в фосфатно-буферный раствор, содержащий антикоагулянт (АДЦ) и раствор ДМАЦ для фиксации и пермеабилизации клеток и замораживали при температуре –15-18°С, хранение до исследования не более 7 суток. Транспортировка до лаборатории осуществлялась в замороженном состоянии на хладагенте. При необходимости образцы освобождали от эритроцитов стандартным методом лизиcа (IO Test Lysing Solution, Beckman Coulter) и фильтровали для получения однородной клеточной суспензии.

Для исследования использовали прямые конъюганты МКА к галектину-3 и HBME-1 человека (Set, BD Bioscience). В качестве отрицательного контроля для прямого метода использовали изотипический контроль (Set, BD Bioscience). Анализ готовых проб проводили на проточном цитометре EPICS XL/MCL (Beckman Coulter) с использованием программы System II. Каждое клеточное событие оценивали по четырем параметрам: прямое светорассеяние – FS (forward side scatter), боковое светорассеяние SS (90° light/side scatter) и два детектора флюоресцентного сигнала. Первый FL-1 – детектор, выявляющий красители зеленого спектра (в данном случае флюоресцеинизотиоционат, обозначаемый как FITC), FL-2 – детектор, выявляющий красители красного спектра (в нашем исследовании фикоэрритрин, обозначаемый как РЕ).

Результаты планового гистологического исследования были сопоставлены с результатами, полученными при изучении уровня экспрессии галектина-3 и HBME-1. На основании полученных данных проводился корреляционный анализ. Для статистической обработки результатов использована компьютерная программа Statistiсa 7.0.

Результаты и их обсуждение

Всем пациентам выполнено плановое гистологическое исследование операционного материала. Результаты сопоставлены с заключениями цитологического исследования (таблица 2).

Таблица 2. Результаты морфологических исследований у больных в изучаемых группах.

Подгруппы (заключение ТАБ)	I Папиллярный рак		II Фолликулярная опухоль			III КЗ
Количество пациентов (чел.)	35		25			5
Заключение гистологического исследования	ПР	АИТ	ФА (ГА)	ФВПР	ФР	КЗ
Количество (чел.)	38	2	31	6	3	5

В первой группе больных, у которых по данным заключения цитологического исследования аспирата узла ЩЖ выявлены признаки папиллярного рака ЩЖ, диагноз высокодифференцированного рака щитовидной железы подтвердился в большинстве случаев, а именно у 38 пациентов поставлен диагноз папиллярного рака ЩЖ. Диагноз рака не подтвердился у двух пациентов, когда в результате гистологического исследования был верифицирован аутоиммунный тиреоидит.

Среди 40 пациентов второй группы с дооперационным диагнозом по данным ТАБ – фолликулярная опухоль, у 31 больных при гистологическом исследовании диагностированы доброкачественные образования ЩЖ: фолликулярная аденома у 28 пациентов, гюртлеклеточная аденома у 3 больных. При плановом гистологическом исследовании у 9 пациентов был диагностирован высокодифференцированный рак щитовидной железы: в трех случаях – фолликулярный рак и в шести – фолликулярный вариант папиллярного рака щитовидной железы.

В третьей группе больных, где по данным цитологического исследования аспирата из узла ЩЖ был диагностирован узловой коллоидный зоб, при гистологическом исследовании диагноз подтвердился в 100% случаев.

Для проведения сравнительного анализа в алгоритм дооперационной диагностики узловых образований ЩЖ кроме цитологического исследования аспирата, полученного при ТАБ, был включен ПФЦ метод исследования экспрессии галектина-3 и HBME-1.

Результаты цитологического исследования аспирата, полученного при ТАБ, ПФЦ метода исследования экспрессии галектина-3 и HBME-1 представлены в таблице 3.

Таблица 3. Сравнение данных ТАБ, гистологического исследования
и результатов определения экспрессии галектина-3 и HBME-1.

ТАБ	Гистологическое исследование	Экспрессия галектина-3	Кол-во	Экспрессия HBME-1	Кол-во
Папиллярный рак (40)	АИТ (2)	Положительная	0	Положительная	0
	Папиллярный рак (38)	Положительная	24	Положительная	21
		Отрицательная	14	Отрицательная	17
Фолликулярная опухоль (40)	Фолликулярная аденома (31)	Положительная	7	Положительная	10
		Отрицательная	24	Отрицательная	21
	ФВПР (6) и фолликулярный рак (3)	Положительная	7	Положительная	4
		Отрицательная	2	Отрицательная	5
Коллоидный зоб (5)	Коллоидный зоб (5)	Отрицательная	5	Отрицательная	3
		Положительная	0	Положительная	2

Среди 40 пациентов первой группы, с предоперационным диагнозом по данным ТАБ – папиллярный рак, экспрессия галектина-3 наблюдалась в 24 случаях, у которых по данным гистологического исследования подтвержден диагноз высокодифференцированного рака щитовидной железы. В 14 случаях, когда экспрессия галектина-3 не определялась, по данным гистологического исследования образования ЩЖ был выявлен папиллярный рак ЩЖ. Экспрессия HBME-1 была выявлена у 21 пациентов с папиллярным раком ЩЖ и не определялась у 17 больных папиллярным. У пациента с верифицированным аутоиммунным тиреоидитом экспрессии ни одного из маркеров выявлено не было.

Среди 40 пациентов второй группы с дооперационным диагнозом по данным ТАБ – фолликулярная опухоль, у 31 больных при гистологическом исследовании диагностированы доброкачественные образования ЩЖ: фолликулярная аденома у 28 пациентов, гюртлеклеточная аденома у 3 больных. При плановом гистологическом исследовании у 9 пациентов был диагностирован высокодифференцированный рак щитовидной железы: в шести случаях – фолликулярный рак и в трех – фолликулярный вариант папиллярного рака щитовидной железы. Цитологический метод в этой группе пациентов имеет 100% чувствительность при нулевой специфичности, что диктует необходимость поиска дополнительных биомаркеров. При исследовании эффективности использования биомаркеров в этой группе пациентов получены наиболее интересные данные. Экспрессия галектина-3 и HBME-1 наблюдалась у 7 больного из 9, у которых по данным гистологического исследования был поставлен диагноз высокодифференцированного рака ЩЖ.

В третьей подгруппе среди 5 пациентов с коллоидными узлами по данным ТАБ экспрессия галектина-3 не была выявлена ни у одного из больных (100%), тогда как экспрессия HBME-1 определялась в 2 случаях.

Для оценки показателей диагностической значимости результаты ПФЦ исследования экспрессии галектина-3 и HBME-1 в аспирате, полученном при тонкоигольной аспирационной биопсии из узловых образований щитовидной железы, были интерпретированы следующим образом (таблица 4).

Таблица 4. Оценка результатов флюороцитометрического исследования экспрессии
галектина-3 и HBME-1 в аспирате, полученном при ТАБ из узловых образований щитовидной железы.

Результат гистологического исследования	Результат исследования экспрессии галектина-3 и HBME-1 в аспирате из узловых образований ЩЖ
	Положительная	Отрицательная
Высокодифференцированный рак ЩЖ	Истинноположительный	Ложноотрицательный
Доброкачественные образования ЩЖ	Ложноположительный	Истинноотрицательный

Положительная экспрессия галектина-3 и/или HBME-1 в аспирате из узла щитовидной железы, полученном при ТАБ, с диагностированным по данным окончательного гистологического исследования высокодифференцированным раком щитовидной железы считалась нами как истинноположительный результат. При отсутствии маркеров в этих образцах результат считался ложноотрицательным.

Положительная экспрессия галектина-3 и/или HBME-1 в аспирате из узла щитовидной железы, полученном при ТАБ, с диагностированными по данным окончательного гистологического исследования доброкачественными образованиями щитовидной железы считалась ложноположительным результатом, а отсутствие этих маркеров – истинноотрицательным результатом.

В группе пациентов с папиллярным раком диагностическая точность использования диагностической панели GAL-3 и HBME-1 составила 67,5%, что достоверно ниже диагностической точности цитологического метода (95%). Таким образом, использование дополнительных методов в диагностике папиллярного рака щитовидной железы не имеет преимуществ перед использованием цитологического метода.

В группе пациентов с неопределенными цитологическими заключениями и послеоперационными доброкачественными заключениями гистологического исследования была выявлена экспрессия галектина-3 и/или HBME-1 в 14 случаях. При сравнении эффективности использования панели биомаркеров Gal-3 и HBME-1 в диагностике рака в группе пациентов с неопределенным заключением ТАБ статистически значимых результатов в сравнении с цитологическим методом не получено (таблица 5).

Таблица 5. Диагностическая значимость комбинированного анализа определения экспрессии
галектина-3 и HBME-1 в группе больных с неопределенными заключениями цитологического исследования.

	Цитологическое исследование (неопределенный результат) (для р<0,05)	Комбинированный анализ экспрессии галектин-3 и HBME-1 (для р=0,074, Хи2 5,750)
Чувствительность	98,9%	77,8%
Специфичность	0,3%	62,2%
Диагностическая точность	22,6%	65,2%
Предсказательная ценность положительного теста	25%	33,3%
Предсказательная ценность отрицательного теста	50%	92%

Однако при изолированном использовании определения экспрессии Gal-3 в диагностике рака чувствительность метода составила 77,8%, специфичность 80,6%, диагностическая точность 80% (р=0,003), что достоверно повышает специфичность цитологического метода исследования (таблица 6).

Таблица 6. Диагностическая значимость изолированного анализа определения экспрессии
галектина-3 и HBME-1 в группе больных с неопределенными заключениями цитологического исследования.

	Анализ экспрессии галектин-3 (для р=0,003)	Анализ экспрессии HBME-1 (для р=0,538)
Чувствительность	77,8%	44,4%
Специфичность	80,6%	73,0%
Диагностическая точность	80%	67,3%
Предсказательная ценность положительного теста	50%	28,6%
Предсказательная ценность отрицательного теста	93,5%	84,4%

Полученные данные показывают, что комбинированный анализ выявления экспрессии галектина-3 и HBME-1 в группе пациентов с цитологическим диагнозом папиллярный рак и коллоидный узел не имеет преимуществ перед «золотым стандартом» – цитологическим методом. Сложности остаются в случаях неопределенных заключений цитологического исследования. Цитологический метод не позволяет дифференцировать фолликулярную аденому и фолликулярный рак, а нередко в эту группу попадают пациенты с фолликулярным вариантом папиллярного рака, что сводит специфичность данного метода к нулю. Мы выполнили попытку с помощью определения экспрессии галектина-3 и HBME-1 методом проточной флуороцитометрии улучшить диагностику высокодифференцированного рака в группе пациентов с неопределенным заключением ТАБ на дооперационном этапе, однако статистически значимых результатов при использовании данной панели маркеров не получили, в отличие от изолированного ПЦФ определения экспрессии Gal-3.

Таким образом, чувствительность цитологического исследования и ПФЦ анализа определения экспрессии галектина-3 достаточно высокая и достоверно не отличается для обоих методов. Однако такой важный показатель, как специфичность метода в диагностике высокодифференцированного рака щитовидной железы, оказался достоверно более высоким для ПФЦ метода определения экспрессии галектина-3. Соответственно, ТАБ с цитологическим исследованием аспирата имеет высокую чувствительность, но низкую специфичность в выявлении злокачественных опухолей, а именно фолликулярного рака. Тогда как ПФЦ метод определения экспрессии галектина-3 имеет высокие показатели чувствительности и достоверно является более специфичным методом в дооперационной диагностике высокодифференцированного рака щитовидной железы.

Таким образом, при выявлении по данным цитологического исследования пунктата из узла щитовидной железы неопределенного результата для уточнения диагноза необходимо выполнить исследование галектина-3, что позволяет улучшить диагностику высокодифференцированного рака щитовидной железы на дооперационном этапе.

Выводы

1. Определение экспрессии белка галектина-3 методом ПФЦ может быть использовано в качестве дополнительного метода дооперационной диагностики высокодифференцированного рака щитовидной железы в группе пациентов с неопределенным результатом цитологического исследования.

2. Сочетанное определение GAL-3 и HBME-1 в группе пациентов с неопределенным цитологическим заключением не улучшает показатели диагностической точности.

Литература

1. Состояние онкологической помощи населению России в 2011 году. Федеральное государственное учреждение «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, Российский Центр информационных технологий и эпидемиологических исследований в области онкологии, под редакцией В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. Москва, 2012 г.
2. Nikiforov YE. Molecular diagnostics of thyroid tumors. Arch Pathol Lab Med. 2011 May; 135(5): 569-77.
3. de Matos LL, Del Giglio AB, Matsubayashi CO, de Lima Farah M, Del Giglio A, da Silva Pinhal MA. Expression of CK-19, galectin-3 and HBME-1 in the differentiation of thyroid lesions: systematic review and diagnostic meta-analysis. Diagn Pathol. 2012 Aug 13; 7: 97.
4. Das DK, Al-Waheeb SK, George SS, Haji BI, Mallik MK. Contribution of immunocytochemical stainings for galectin-3, CD44, and HBME1 to fine-needle aspiration cytology diagnosis of papillary thyroid carcinoma. Diagn Cytopathol. 2013 Nov 22.
5. Nascimento MC, Bisi H, Alves VA, Longatto-Filho A, Kanamura CT, Medeiros-Neto G. Differential reactivity for galectin-3 in Hurthle cell adenomas and carcinomas. Endocr Pathol. 2001; 12: 275-279.
6. Mase T, Funahashi H, Koshikawa T, et al. HBME-1 immunostaining in thyroid tumors especially in follicular neoplasm. Endocr J. 2003; 50: 173-177.