Онкогеномика. Мастер-класс проф. Д.В. Залетаева

Генетические маркеры

Онкогеномика. Генетические маркеры

Мутации

Все изменения последовательности нуклеотидов в ДНК, независимо от локализации и влияния на жизнеспособность клетки, – мутации. Нейтральные мутации или полиморфизмы – последовательности ДНК, не приводящие к заметным нарушениям функций.

Существуют две классификации мутаций (Strachan T., Read A., 2003). Одна базируется на функциональной характеристике и не рассматривает характер самой мутации. Вторая классифицирует мутации по структурным изменениям в ДНК и РНК.

Функциональная классификация подразделяет мутации:

  1. связанные с потерей функции белка;
  2. связанные с приобретением новой аномальной функции белка;
  3. в регуляторных областях гена, приводящие к количественным изменениям первичного белкового продукта.

Структурная классификация выделяет следующие типы:

  1. нонсенс-мутация – изменение в нуклеотидной последовательности ДНК кодирующей области гена, приводящее к возникновению стоп-кодона и преждевременному прекращению синтеза белка;
  2. миссенс-мутация – изменение в нуклеотидной последовательности ДНК кодирующей области гена, приводящее к изменению одной аминокислоты, что не нарушает процесс синтеза белка;
  3. мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания белка и возникновению стоп-кодона на некотором расстоянии от самой мутации, что приводит к преждевременной терминации синтеза белка. Мутации сдвига рамки считывания вызываются делециями и инсерциями, не кратными трем (кодон = 3) нуклеотидам;
  4. мутации в сайтах сплайсинга приводят к тому, что нарушается процессинг мРНК, что ведёт к: а) делеции всего или части экзона; б) обычно удаляемые интронные области могут стать смысловыми. Такая патология приводит к сдвигу рамки считывания и появлению стоп-кодона. В результате белковый продукт гена не только укорачивается, но и может оказаться совершенно аномальным.

Для злокачественных опухолей характерны все типы мутаций. Высокоинформативными структурными ДНК-маркерами, позволяющими проводить раннюю диагностику опухолевого процесса, определять прогноз развития заболевания и подбирать наиболее эффективные варианты терапии, являются характерные нарушения нуклеотидной последовательности белок-кодирующих генов в некоторых типах опухоли.

ДНК-диагностика мутаций может быть косвенной и прямой (Strachan T., Read A., 2003).

При прямой диагностике предметом анализа являются мутации гена. Прямые методы возможны лишь при наличии информации об экзон-интронной организации или полноразмерной нуклеотидной последовательности ДНК гена.

ПЦР с использованием определенного фермента гидролиза ДНК возможна при стандартной мутации с изменением сайта рестрикции, если без изменения сайта рестрикции – аллель-специфическая ПЦР.

Определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, показавшего аномальную электрофоретическую подвижность, и заключительным этапом анализа мутаций является их секвенирование. Прямое секвенирование позволяет с 100% эффективностью определить мутацию.

В косвенной диагностике мутаций используются несколько методов. Наиболее просто при электрофоретическом анализе обнаруживаются мутации, изменяющие длину амплифицированных фрагментов ДНК.

Для выявления точковых мутаций, небольших делеций и инсерций в исследуемых генах используется множество различных подходов, основанных на методе полимеразной цепной реакции. При ПЦР возможно многократно увеличить уникальную последовательность ДНК, а затем проанализировать её на наличие мутации.

Метод конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP) – один из наиболее простых в исполнении высокочувствительных методов поиска однонуклеотидных замен в исследуемом участке геномной ДНК. Оптимальный размер исследуемого фрагмента ДНК 200-250 п.н., при котором вероятность обнаружения мутаций составляет 70-95%.

Вероятность идентификации точковых мутаций методом гетеродуплексов достигает 80-90% при длине фрагментов ДНК не более 300 п.н. Метод основан на том, что за счет конформационных особенностей в местах несовпадения нуклеотидов электрофоретическая подвижность гетеродуплексов, образующихся при комплиментарном взаимодействии мутантной и нормальной ДНК отличается от подвижности гомодуплексов нормальных фрагментов ДНК.

Наиболее распространенным способом скрининга мутаций, позволяющим выявить точковые мутации почти в 100% случаев и не требующим больших затрат времени, считается комбинация анализа гетеродуплексов и метода однонитевого конформационного полиморфизма.

 
Служба «Ясное утро». Всероссийская горячая линия психологической помощи онкологическим больным и их близким
Content

Уважаемые коллеги

При обнаружении ошибки просим информировать нас об этом.

Имя

E-mail *

Местонахождение ошибки *

Подробнее: в каком абзаце ошибка, в чем она состоит *

Картинка с кодом

Обновить картинку Прослушать код Введите код:

Согласен Данный веб-сайт содержит информацию для специалистов в области медицины. В соответствии с действующим законодательством доступ к такой информации может быть предоставлен только медицинским и фармацевтическим работникам. Нажимая «Согласен», вы подтверждаете, что являетесь медицинским или фармацевтическим работником и берете на себя ответственность за последствия, вызванные возможным нарушением указанного ограничения. Информация на данном сайте не должна использоваться пациентами для самостоятельной диагностики и лечения и не может быть заменой очной консультации врача.

Сайт использует файлы cookies для более комфортной работы пользователя. Продолжая просмотр страниц сайта, вы соглашаетесь с использованием файлов cookies, а также с обработкой ваших персональных данных в соответствии с Политикой конфиденциальности.