Результаты изучения онкогенных потенций медицинских клеточных препаратов на иммунодефицитных мышах

Н.В. Андронова, Н.Т. Райхлин, Е.М. Трещалина, Н.В. Шалунова, А.Ю. Барышников
РОНЦ им. Н.Н. Блохина; ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора РФ

Investigation of tumorigenicity the different cell preparations
on immunodefficient mice

N.V. Andronova, N.T. Raichlin, H.M. Treshalina, N.V. Shalunova, A.Yu. Baryshnikov
Blokhin Cancer Research Center, Russia, Moscow; Federal State Institutions, State Research Institute for standardization and control of medical biological preparations named of L.A. Tarasevich

---

Введение

В последние годы в России принят ряд важных правительственных решений по вопросам развития высокотехнологичных видов медицинской помощи, среди которых открытие новых криобанков для клеточных культур, основы клеточных медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) [18]. Предпосылкой этому были разработки и успешное применение многих клеточных препаратов на основе различных функционально активных клеток [4,5,8,19,25,26,30,31,35]. МИБП проявляют регуляторно-репаративное и иммуностимулирующее действие, ориентированное на различные терапевтические цели. Соответственно свойствам МИБП используются для посттравматической реконструкции тканей [3,4], тканевой инженерии крупных сосудов [5,24,27], лечения инсулин-зависимого сахарного диабета [1,2,25,41], производства противоинфекционных или противоопухолевых вакцин и/или для заместительной терапии [11,23,39,41].

На доклинической стадии изучаются мезенхимальные и эмбриональные стволовые клетки (МСК, ЭСК), способные к переживанию in vivo [7,23,29]. Поскольку имплантаты из культур клеток in vivo достаточно уязвимы для иммунологического надзора хозяина, разрабатываются методы иммобилизации с использованием различных матриксов в виде близких к структуре губчатой кости микро- или трехмерных капсул (скаффолдов), в том числе из металлов [18,26,33-36,38]. Однако при этом возрастает опасность малигнизации клеток внутри «скаффолда» in vivo, не только в результате исключения иммунной реакции на атипичные клетки, но и по причине реставрации исходного клеточного фенотипа. Морфологические исследования срезов могут выявить возможную атипию, но только в мягких материалах. Канцерогенная или мутагенная активность некоторых металлов (никель или хром) известны, а онкогенные потенции современных пористых материалов из других металлов, например, титана, не изучены [16].

Применение новых МИБП невозможно без доклинического изучения их безопасности, что регламентировано рядом документов [13-15]. Одним из обязательных разделов доклинического изучения МИБП является определение онкогенных потенций или туморогенности, т.е. способности вызывать развитие злокачественной опухоли. Для выявления этого побочного действия на доклиническом этапе в настоящее время используются различные методики, наиболее достоверной из которых является подкожная (п/к) имплантация клеточного препарата мышам, лишенных трансплантационного иммунитета. Среди рекомендованных для изучения туморогенности животных – обычные иммунокомпетентные мыши, депрессированные классическими иммунодепрессантами (циклоспорином, азатиоприном, имураном, циклофосфаном, антилимфоцитарной, антитимоцитарной сыворотками или антилимфоцитарным иммуноглобулином), или наследственные иммунодецифитные мыши (ИДМ), полученные нокаутированием генов, ответственных за трансплантационный иммунитет. Обычные иммунокомпетентные мыши дешевле и не требуют особых условий содержания, но биологически не вполне адекватны для современных МИБП. Но применение депрессанта создает не длительную, а временную иммуносупрессию, что не дает возможности достоверно оценить отдаленные проявления туморогенности, особенно при изучении иммобилизованных или инкапсулированных на носителях препаратов с отсроченным эффектом [28,31,42]. Кроме того, наличие индуцированной системной иммуносупрессии, подавляющей все иммунные клеточные реакции, не дает возможности выявить пролиферативную активность клеток в лимфатических узлах (мишенях возможного метастазирования) и дифференцировать ее от воспалительных изменений при применении нестерильных объектов. ИДМ биологически интактны, т.к. не подвергаются экзогенным иммунодепрессивным воздействиям и вследствие этого могут давать адекватный биологический ответ на наличие туморогенности, как в отношении опухолевого узла, так и диссеминации процесса [42]. Важно то, что в качестве контроля в опытах на ИДМ параллельно используется группа животных, которым имплантируется такое же количество раковых клеток с близким к исследуемому препарату гистогенезом из доступных коллекций культур клеток [9,21], что дает возможность иметь доказательный отрицательный результат.

Для подтверждения значимости указанной модели с использованием ИДМ при изучении онкогенных потенций МИБП различного происхождения, состава и назначения было предпринято настоящее исследование. В исследование включены МИБП интактные, в том числе нестерильные, и иммобилизованные на различных носителях, включая скаффолды из пористого титана.

Цель исследования – на иммунодефицитных мышах Balb/c nude оценить результативность выявления онкогенных потенций современных иммунобиологических препаратов, предназначенных для клинического применения.

Задачи исследования включали составление плана экспериментального исследования для каждого МИБП или иммобилизующего объекта; выбор адекватной культуры опухолевых клеток для группы контроля; выявление признаков опухолевого роста или метастазирования и контроль скорости роста пальпируемых новообразований при визуальном наблюдении места имплантации/инокуляции; выявление морфологических признаков опухолевого роста или метастазирования в месте имплантации/инокуляции и области регионарного и отдаленного метастазирования, а также выявление визуальных и патоморфологических признаков реактивного воспаления в зонах возможной локализации метастазов и дифференциальная диагностика со специфическим поражением.

Материалы и методы исследования

Животные. Для экспериментов использованы конвенциональные 6-8 нед. мыши-самки Balb/c nude массой тела 19-21 г из разведения РОНЦ им. Н.Н. Блохина, которых содержали в специализированном кондиционированном отсеке (2 зоны) на стерильных бумажной подстилке, экструдированном корме («МЭСТ», РФ) и питьевой воде. В каждой группе было 60-70 мышей, которых делили на 2 группы по 30-35 особей (группа опыта и группа контроля). В опытную группу входили мыши, которым однократно подкожно выполняли инъекцию по 1,0 млн. исследуемого клеточного препарата или подшивали один скаффолд – имплантат-носитель (ИН) пустой или содержащий 1,0 млн. исследуемых клеток. Для групп контроля культуры опухолевых клеток человека получали из Банка опухолевых штаммов РОНЦ [10] или из Российской коллекции клеточных культур [21] и вводили мышам однократно подкожно по 1,0 млн. клеток. Контролем для препаратов, полученных из легкого эмбриона человека, служила линия клеток рака легкого человека А-549; для препаратов, полученных из фибробластов или МСК, – линия клеток рака кожи человека А-431 [10], для вакцины «Мелавак» – исходная культура клеток меланомы человека Mel Kor [17]. До перевивки по прижизненной окраске трипановым синим определено 98% живых клеток в культуре.

Изученные агенты. Всего изучено 7 образцов. Среди них 4 нативных клеточных препарата, в том числе 2 культуры диплоидных клеток человека, полученных из легкого эмбриона (штаммы ЛЭЧ 4/81 [9] и MRC-5 [34]), 1 культура фибробластов (штамм cmbt-F [40]), 1 новая противоопухолевая вакцина «Мелавак» из культуры клеток меланомы человека Mel Kor, подвергнутых ионизирующему облучению [16], 2 препарата культуры аутологичных хондропрогениторных клеток из МСК, иммобилизованных в трехмерных скаффолдах коллагеновых или OPLA [22], а также ИН из пористого титана, предназначенные для иммобилизации лимфокинактивированных клеток человека (ЛАК) [6,20].

1. Штамм ЛЭЧ 4/81. Медицинский иммунобиологический препарат «Культуры клеток диплоидных человека для заместительной терапии» (ККДЧ) представляет собой культуру диплоидных клеток легкого эмбриона человека ЛЭЧ 4/81 (Спецификация ATCC на CCL 5; ECACC 89111004; ЕСКК. LECH-4), которая получена однократно в Екатеринбургском НИИ вирусных инфекций МЗ РФ в 1972 г. Препарат представляет собой морфологически однородную популяцию клеток с ограниченным сроком жизни, определенного тканевого происхождения, имеющих частичную дифференцировку, по фенотипу – фибробластоподобную. Культура клеток сохраняет стабильный кариотип (2n не менее 75% клеток), лишена антигенов гистосовместимости (HLA). В предварительных опытах на обычных мышах, обработанных антитимоцитарной сывороткой (СП 3.3.2.561-96), установлено отсутствие туморогенности. Клеточная 3-4-суточная культура на 10 пассаже в лекарственной форме с концентрацией 50-100 тыс. клеток в 1 мл/см² рекомендована для лечения глубоких поражений кожных и слизистых покровов. Препарат производится ООО Компании «Медицина и биотехнологии» (Екатеринбург).

2. Штамм MRC-5. Линия диплоидных клеток человека MRC-5 представляет собой клеточную взвесь и является субстратом для производства вакцины против краснухи. MRC-5 получена из легкого эмбриона человека (автор Дж.П. Джекобс, 1966 г.) и закуплена на 14 пассаже в АТСС (спецификация ATTC на ССL-171). Исследование выполнено с 23 пассажем MRC-5, последние 3 пассажа велись без добавления антибиотика. Препарат производится ФГУП НПО «МИКРОГЕН» МЗ РФ (Москва).

3. Штамм cmbt-F/7. Субстанция клеточной культуры диплоидных фибробластов человека cmbt-F/7 является суспензией живых, функционально активных клеток, обладающих выраженным регуляторно-репаративным действием, с пролонгированным до 7 дней эффектом, связанным с переживанием клеток. Культура представлена морфологически однородной популяцией пластик-адгезивных веретенообразных клеток (индекс пролиферации ≥2), предварительно культивированную на искусственных питательных средах, стерильную. Клетки экспрессируют человеческие аллели главного комплекса гистосовместимости и синтезируют коллаген I и II типа. Сmbt-F/7 обладает ранозаживляющим действием, стимулирует рост новых микрососудов, улучшая трофику тканей, стимулирует регенерацию поврежденных тканей кожи, слизистых оболочек. Препарат производится ООО «Центр медико-биологических технологий – ЦМБТ-Лабораторис» (Москва).

4. Вакцина «Мелавак» представляет собой клеточную линию меланомы человека Мel Kor, стабильно трансфецированную человеческим геном ГМ-КСФ, имеет генетическую конструкцию: вектор pBK – CMV (Clon Tech, США) со встроенной к ДНК ГМ-КСФ человека. Вид трансфекции – стабильная, интегрированная. Метод трансфекции – липофекция, при помощи набора Unifectin 56. Уровень трансфекции – 100%. Количество секретируемого ГМ-КСФ клетками – 78,1-84,0 нг / 1 млн. клеток / 24 часа. Перед введением животным вакцина инактивирована на γ-установке АГАТ-Р облучением в дозе 100 гр. Вакцина предназначена для клинического изучения у больных меланомой кожи в качестве средства иммунотерапии, производится РОНЦ им. Н.Н. Блохина.

5-6. Иммобилизованная культура дифференцированных МСК. Хондропрогениторные клетки человека получены из МСК, выделенных в результате липосакции из подкожно-жировой клетчатки пациентов по оригинальной методике [23]. Митотический индекс для каждой популяции клеток не менее 1х10⁶. Направленная дифференцировка МСК в хондропрогениторные клетки выполнена с помощью TGFβ1 100 нг/мл в дифференцировочной среде DMEM-LG с антибиотиками без сыворотки. Клетки трипсинизированы и подсчитаны, через 3 нед. фиксированы и окрашены толуидиновым синим, сафронином О, alcian blue. Для культивирования использован внеклеточный матрикс (ВМ), представляющий собой природную подложку для тканевого развития и репарации тканей. Для получения трехмерной структуры использованы продажные (РФ, Германия) матриксы коллагеновые или на основе OPLA, которые насыщались полученной культурой клеток. ТТИ стерильны, переданы на исследование в физиологическом растворе хлористого натрия в центрифужных пробирках объемом 15 мл. После извлечения из среды ТТИ готов для трансплантации. Препарат произведен в ООО «Институт стволовой клетки» (Москва).

7. Имплантаты-носители из пористого титана для ЛАК. Имплантат-носитель (ИН) представляет собой пористый титан, полученный из спеченного титанового порошка. После спекания порошинки образуют упругий прочный каркас с открытыми порами размером от 50 до 200 мкм, подобно губчатому веществу бедренной кости человека. ИН производится ООО «Центр информационно-клеточной медицины» (г. Москва).

Оценка онкогенных потенций. Исследования выполнены в соответствии с методическими указаниями [14]. Визуальный контроль места имплантации/инокуляции и признаков реактивного воспаления за опытными и контрольными группами мышей производился в течение 21 с. в случае нативного препарата и 56 дней в случае иммобилизованного на носителе. В процессе наблюдения регистрировали общее состояние мышей и следили за развитием каких-либо опухолевых проявлений в месте инокуляции визуально и путем многократной пальпации места введения и заинтересованных лимфатических узлов. Одновременно следили за динамикой роста опухоли под кожей у мышей по измеримым узлам, для чего многократно измеряли объем пальпируемых образований, вычисляли средний объем и рассчитывали доверительный интервал для определения скорости роста опухоли. В процессе наблюдения фиксировали гибель мышей от внешних причин, связанных с наличием иммунодефицита. На 21 с. после инокуляции или имплантации тестируемых образцов всех мышей умерщвляли с помощью передозировки эфирного наркоза и подвергали аутопсии. При вскрытии мышей макроскопически оценивали состояние внутренних органов: кожи в месте введения, регионарных подколенных и аксиллярных лимфатических узлов, легких, почек и печени для выявления каких-либо поражений, напоминающих опухоль. Регионарные лимфатические узлы и легкие подвергали гистологическому исследованию. Морфологические признаки опухолевого роста, метастазирования или реактивного воспаления выявляли путем стандартного гистологического исследования материала, который фиксировали в 10% нейтральном формалине, заключали в парафин. Из парафиновых блоков готовили срезы толщиной 5-7 μк и окрашивали гематоксилин-эозином. Препараты просматривали и фотографировали в световом микроскопе «Поливар» (Австрия). В полученных гистологических препаратах оценивали наличие признаков злокачественного роста, а также воспалительных изменений.

Статистическая обработка данных. Использован стандартный метод Стьюдента в модификации Р.Б. Стрелкова для обработки параметров роста пальпируемых опухолей.

Завершение эксперимента. В соответствии с Правилами работы с лабораторными животными выживших животных умерщвляли путем передозировки эфирного наркоза. Трупы погибших или умерщвленных мышей подвергали замораживанию и кремировали в специализированном подразделении РОНЦ.

Результаты и обсуждение

В течение всего периода наблюдения за мышами в области инокуляции или имплантации стерильных нативных клеточных препаратов (ЛЭЧ 4/81, cmbt-F/7, вакцина «Мелавак») каких-либо визуальных или морфологических признаков опухолевого роста в месте введения, внутренних полостях и органах, метастазирования или реактивного воспаления не обнаружено. При визуальном обследовании и многократной пальпации (1 раз в 5 дней) мышей, получивших нестерильный образец 23-го пассажа MRC-5, каких-либо визуальных или морфологических признаков опухолевого роста не обнаружено. Однако у 7 мышей в этой группе при визуальном обследовании обнаружен двусторонний регионарный лимфаденит (подколенные лимфоузлы). Гистологическое исследование выявило лимфаденит в 2-х группах подколенных и аксиллярных лимфоузлов, не дающий возможности оценить истинную картину. При дополнительном исследовании стерильного образца MRC-5 эти изменения отсутствовали.

При изучении иммобилизованных препаратов показано, что в случае использования скаффолдов коллагеновых или OPLA, насыщенных клеточным материалом человека, каких-либо визуальных или морфологических проявлений туморогенности нет. Однако через 4-7 дней начиналось постепенное врастание фибробластов мыши в скаффолд, и к концу наблюдения инокулят оказывался практически вытесненным. Склерозирование микширует реальную картину состояния клеток, в том числе возможную малигнизацию. При использовании ИН из пористого титана пустых или насыщенных ЛАК признаков туморогенности также не выявлено, однако интенсивная реакция соединительно-тканных элементов мыши даже на пустые носители была более резко выражена.

Для выяснения судьбы попавших в зоны склерозирования имплантированных клеток ИН были подшиты в брюшную полость обычных мышей, и оказалось, что в прослойках соединительной ткани находится большое количество жизнеспособных клеток с митозами. Рост опухолей человека у мышей контрольных групп после инокуляции 1 млн. клеток на мышь был стандартным по срокам появления и скорости роста пальпируемых подкожных узлов, но при неполной прививаемости: в случае А-549 опухоли появились у 68-71% мышей, в случае А-431 – у 43-46% животных. Исключение составила культура клеток Mel Kor, которая дала 100%-ную прививаемость. Морфологическое исследование подтвердило развитие специфического опухолевого поражения и отсутствие признаков метастазирования для всех использованных контрольных опухолевых культур, что характерно для использованных моделей.

Выводы

1. Иммунодефицитные бестимусные мыши nude удовлетворяют цели изучения онкогенных потенций современных иммунобиологических препаратов, предназначенных для клинического применения.

2. Выбор адекватной культуры опухолевых клеток для группы контроля позволяет верифицировать опухолевый процесс в качестве отрицательного контроля.

3. Визуальная и патоморфологическая оценка патологических изменений в зонах имплантации и возможной локализации метастазов клеточного материала или его носителя дает возможность выявить признаки реактивного воспаления для дифференциальной диагностики со специфическим поражением.

4. Носители клеточного материала любого происхождения провоцируют пролиферацию соединительно-тканных элементов хозяина, на фоне которой трудно достоверно верифицировать жизнеспособные потенциально злокачественные клетки, что требует более длительного периода наблюдения и повторной морфологической верификации.

Литература

1. Беникова Е.А., Турчин И.С., Белякова Л.С. и др. Опыт лечения детей, страдающих сахарным диабетом, при помощи алла- и ксенотрансплантации культуры островковых клеток поджелудочной железы//Проблемы эндокрин. – 1987 г.-№2.-с. 19-22.
2. Блюмкин C.Н., Скалецкий Н.Н., Попов В.Л. и др. Внеселезеночная трансплантация культур островковых клеток поджелудочной железы плодов человека крысам с экспериментальным сахарным диабетом//Бюл. Эксп. Биол. и мед.- 1983 г.-№5.- с. 89-91.
3. Буравкова Л.Б., Капланский А.С., Андреева Е.Р. и соавт. Особенности формирования костной мозоли у крыс после введения в область перелома мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, культивированных при различном содержании кислорода//Клет. Транспл.- 2009 г.-сен.-т.IV.-№3.-стр. 52-57.
4. Григорян А.С., Гилерович Е.Г., Павличенко Н.Н. и соавт. Влияние трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на посттравматические процессы при экспериментальной травме головного мозга//Клет. Транспл.-2009 г.-сен.-т.IV.-№3.-стр. 58-67.
5. Григорян А.С., Кругляков П.В. Применение в тканевой инженерии крупных сосудов трансплантатов на основе аутогенных мононуклеарных клеток костного мозга//Клет. Транспл.- 2009 г.-сен.-т.IV.-№3.-стр. 37-41.
6. Давыдов М.И., Нормантович В.А., Киселевский М.В. и соавт. Адоптивная иммунотерапия при опухолевых плевритах. Клинико-лабораторное исследование//Российский онкологический журнал.-2000.-№6.-стр. 14-17.
7. Донцов В.И., Чернилевский В.Е. Пересадка эмбриональных клеток: новые возможности в биологии и медицине//Ж. Профилактика старения.-2001 г.-вып.4.-стр. 78-84.
8. Зорин В.Л., Зорина А.И., Черкасов В.Р. Анализ зарубежного рынка регенеративной медицины//Клет. Транспл.- 2009 г.-сен.-т.IV.-№3.-стр. 68-78.
9. Кармацких О.Л., Ерофеев С.А., Кононович Н.А. и cоавт. Опыт использования иммунологического препарата диплоидной клеточной культуры ЛЭЧ-4 (81) для замещения локального дефекта костной ткани длинных трубчатых костей собак// Гений ортопедии: научно-теоретический и практический журнал.–2006.–N1.–С. 17-21. – ISSN 1028-4427.
10. Трещалина Е.М., Ревазова Е.С., Соловьев Ю.Н. и соавт. Коллекция опухолевых штаммов человека.-под ред. акад. РАН и РАМН, засл. деятеля науки РФ, проф., д.м.н. М.И. Давыдова// М.-«Практическая медицина», С. 233.
11. Комиссаренко В.П., Турчин И.С., Комиссаренко И.В. и др. Трансплантация культуры островковых клеток поджелудочных желез плодов человека и животных как метод лечения сахарного диабета//Врач. Дело.-1983 г.-№4.-с. 52-56.
12. Кругляков П.В., Григорян А.С. Рецензия на книгу «Биология стволовых клеток и клеточные технологии» под редакцией М.А. Пальцева//Клет. Транспл.-2009 г.-сен.-т.IV.-№3.-стр. 79-80.
13. Методические указания «Выделение, культивирование и контроль штаммов диплоидных клеток». Одобрено Советом ГИСК им. Л.А. Тарасевича МЗ СССР, протокол №14 от 29.09.1978 г. МЗ СССР.-М.-1979 г.-стр. 37.
14. Методические указания «Аттестация перевиваемых клеточных линий – субстратов производства и контроля медицинских и иммунобиологических препаратов».-РД-42-28-10-89.-МЗ СССР.-М.-1989 г.-стр. 10-21.
15. Методические указания «Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов. Основные положения». РД42-28-8-89.-МЗ СССР.-М.-1989 г. С. 26.
16. Авцын А.Б.М. Микроэлементы человека: этиология, классификация, органопатология. //Медицина, 1991 г., С.496 с.
17. Михайлова Л.М., Ермакова Н.П., Меркулова И.Б. Исследование туморогенности противоопухолевой вакцины мелавак//Российский биотерапевтический журнал.-2007 г.-№1.-т.6.-стр. 60-61.
18. Новиков И.И. Морфологические изменения губчатого вещества кости после его трансплантации под фиброзную капсулу почки//Архив анатомии, гистологии и эмбриологии.-1972 г.-№1.-с. 31-37.
19. Панарин Е.Ф., Нудьга П.А., Петрова В.А. и соавт. Матрицы для культивирования клеток кожи человека на основе природных полисахаридов – хитина и хитозана//Клет. Транспл.-2009 г.-сен.-т.IV.-№3.-стр. 42-46.
20. Панин А.М., Иванов С.Ю., Нури Ф. и соавт. Морфологическое изучение тканевых реакций на подкожную имплантацию биоматериалов//Биомедицинская технология. (Репродукция тканей и биопротезирование).-2001.-№17.-стр. 55-63.
21. Полянская Г.Г. и соавт. //Российская коллекция клеточных культур, Коллекция: ATCC CCL 185; ECACC 86012804, НИИ вирусологии РАМН; НИИ гриппа РАМН; ИНЦ РАН.-J.Natl.Cancer Inst. 1973. 51: 14171423; Int. J. Cancer 1976. 17: 6270; Tissue Antigens 1978. 11: 279.
22. Путин В.В. О единой национальной системе высокотехнологичной медицинской помощи. Порядок открытия новых медицинских центров, лабораторий, криобанков в России Стенографический отчёт о совещании по вопросам развития высокотехнологичных видов медицинской помощи http://www.biocells.ru/vip-money-5-5.html.
23. Тепляшин А.С., Коржикова С.В., Шарифуллина С.З., Ростовская М.С., Чупикова Н.И., Васюнина Н.Ю., Андронова Н.В., Трещалина Е.М., Савченкова И.П. //Дифференцировка мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга человека в клетках хрящевой ткани при культивировании их в трехмерных матриксах OPLA.-Ж.Цитология.-2007 г.-т.49.-№7.-стр. 544-551.
24. Трансплантология: Руководство.- под ред. В.И. Шумакова. -М.-Медицина.- 1995 г.-С. 391.
25. Шумаков В.И., Блюмкин В.Н., Скалецкий Н.Н. и соавт. Трансплантация культур островковых клеток поджелудочной железы (очерки)//М.-Медицина.- 1994 г.-С. 384.
26. Третьяк С.И. Длительное сохранение жизнеспособности аллогенных тканей в сосудах и сердце реципиента (экспериментальное исследование)//Автореф. дисс. докт. мед. наук.-Минск, 1996 г.- С. 33.
27. Третьяк С.И., Прохоров А.В., Глинник А.А. Отдаленные результаты ксенотрансплантации макроинкапсулированной культуры островковых клеток поджелудочной железы//Трансплантология.-2004 г.-т.7-№3.-с. 364-366.
28. Трещалина Е.М., Андронова Н.В. Райхлин Н.Т. Изучение онкогенных потенций различных иммунобиологических препататов на иммунодефицитных мышах Российский биотерапевтический журнал.-Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты».-М.-2009 г.-№2.-стр. 22.
29. Appel J.Z., Alwayn J.P.N., Cooper D.K.C. Xenotransplantation: the challenge to current psychological attitudes// Progress in Transplantation – 2000-Vol. 10-№4-p 217-225.
30. Abbas A.K., Murphy K.M, Sher A. Functional diversity of helper T lymphocytes//Nature – 1996 – №383 – p1059-1066.
31. Badet L., Titus T. et al. The interaction between rpimate blood and mouse islets induces accelerated clotting with islet destruction//Xenjtransplantation.-2002.-№9.-Issue 2.-p.91.
32. Brunetti P., Basta G. et al. Immunoprotection of pancreatic islet grafts within artificial microcapsules//Int.J.Artif.Organs-1991-№14-p.789-791.
33. De Vos P., Wolters G.H. et al. Obstacles in the application of microencapsulation in islet transplantation// Int. J. Artif. Organs-1993-№16-p205-212.
34. De Vos P., De Haan B.J. et al. Association between capsule diameter, adequacy of encapsulation and survival of microencapsulated rat islet allografts//Transplantation – 1996 – №62 – P. 893-899.
35. Jacobs J.P., Jones C.M., Baille J.P. Characteristics of a human diploid cells designated MRC-5//Nature.-1970.-v.227.-p. 168-170.
36. Juang J.H., Bonner-Weir S., Vacantu J.P. et al. Outcome of subcutaneous islet transplantation improved by a polymer device//Transpl. Proc. – 1995-№27-p. 3215-3216.
37. Lanza R.P., Hayes J.L., Chic W.L. Encapsulated cell technology// Biotechnology-1996-N14-p. 1107-1111.
38. Prevost P., Flori S. et al. Application of AN 69 hydrogel to islet encapsulation. Evaluation in streptozotocin-induced diabetic rat model//Ann. NY Acad. Sc.-1997-Vol.831.-Issue 1-p. 344-349.
39. Rayat G.R., Rajotte R.V., Korbutt G.S. Potential application of neonatal porcine islets as treatment for type 1 diabetes: a review//Ann NY Acad. SCI.-1999-№875-p. 75-188.
40. Rogers SA, Chen F, Talcott M, Liapis H, Hammerman MR. Glucose tolerance normalization following transplantation of pig pancreatic primordia into non-immunosuppressed diabetic ZDF rats//Transpl. Immunol.-2006.-Nov.-v.16.-№3-4.-р. 176-184.
41. Stevens R.B., Matsumoto S., Marsh C.L. Is islet transplantation a realistic therapy for the treatment of type 1 diabetes in the near future//Clinical Diabetes-200 l-№19-p. 51-60.
42. Todo S., Fung J.J. et al. Liver, kidney and thoracic organ transplantation under FK506//Ann. Surg.-1990-№212-p. 295-305.